次 頓，潘 虎，達(dá)娃卓瑪，李 穎，魏 娜

(西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測研究所，西藏 拉薩 850032)

【研究意義】酥油是西藏地區(qū)重要的傳統(tǒng)乳制品。酥油營養(yǎng)價(jià)值極高，含有豐富的乳脂肪、微量元素和不飽和脂肪酸，是藏族群眾制作酥油茶的主要原料。酥油豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和較高的水分含量為微生物的滋生與繁殖創(chuàng)造了非常適宜的環(huán)境條件。酥油微生物的種類和數(shù)量直接影響酥油產(chǎn)品的品質(zhì)和安全性。一方面，酥油在乳酸菌等有益微生物作用下會(huì)產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)，從而改善產(chǎn)品品質(zhì)[1]；另一方面，酥油在霉菌等有害微生物作用下，極易引起酸敗或產(chǎn)生毒素[2]，從而威脅酥油的消費(fèi)安全。【前人研究進(jìn)展】目前對酥油的研究主要集中在成分分析3]、貯存條件[4]以及新產(chǎn)品開發(fā)[5]等方面，對酥油中微生物的探討鮮有報(bào)道[6]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本文以拉薩地區(qū)酥油為研究對象，采用PCR-DGGE技術(shù)分析酥油中的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)，從而揭示拉薩地區(qū)酥油中的主要微生物類群?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過本文研究為進(jìn)一步提高拉薩地區(qū)酥油的微生物品質(zhì)和質(zhì)量安全提供重要數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

儀器：PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad C1000型)，變性梯度凝膠電泳儀(Bio-Rad 1709080型)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad Gel-Doc2000型)。

表1 酥油樣品采集信息表

試劑： 土壤DNA提取試劑盒(天根公司)，DNA Gel Extraction Kit試劑盒(OMEGA公司)，Poly-Gel DNA 提取試劑盒(OMEGA公司)，PMD18-T載體(天根公司)，DH5α感受態(tài)細(xì)胞(天根公司)，丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、過硫酸銨、硼酸、Trizma堿、EDTA、冰醋酸、硝酸銀等試劑均購自天根公司，GC-338F/518、GC-FR1/FF390、338F/518R和FR1/FF390等引物由上海美吉生物公司合成。

1.2 酥油樣品的采集

酥油樣品于2014年9月采集于拉薩及其周邊地區(qū)，共采集代表性樣品15份，每份樣品采集數(shù)量為2～3 kg，樣品放置于專用無菌采樣袋中。具體采樣信息見表1。

1.3 酥油微生物總DNA的提取與PCR擴(kuò)增

按照天根DNA提取試劑盒說明中方法步驟，對酥油樣品中微生物總DNA進(jìn)行提取。然后再分別以提取的各樣品微生物總DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物GC-338F/518R擴(kuò)增16S rDNA高變區(qū)序列；采用真菌通用引物GC-FR1/FF390擴(kuò)增樣品18S rDNA高變區(qū)序列。PCR擴(kuò)增程序參考Dong XL等[7]，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit純化回收。

1.4 變性梯度凝膠電泳及圖像數(shù)據(jù)分析

取10 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析。16S rDNA高變區(qū)序列PCR產(chǎn)物采用變性梯度為35 %～55 %、濃度為7 %的聚丙烯酰胺凝膠在1×TAE緩沖液中150 V 60 ℃下電泳5 h；18S rDNA高變區(qū)序列PCR產(chǎn)物采用變性梯度為30 %～50 %、濃度為7 %的聚丙烯酰胺凝膠在1×TAE緩沖液中150 V 60 ℃下電泳7 h。變性梯度凝膠電泳完畢后，采用硝酸銀進(jìn)行染色，染色后用Bio-Rad 公司的Gel-Doc2000 進(jìn)行掃描成像，進(jìn)一步利用Quantity One軟件讀取圖像上各條帶的強(qiáng)度，根據(jù)電泳圖譜中樣品條帶數(shù)目及每個(gè)條帶的強(qiáng)度，計(jì)算Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H’)，從而表征酥油微生物的多樣性[8]。

其中，pi為樣品中單一條帶的強(qiáng)度在該樣品所有條帶總強(qiáng)度中所占的比率，N為DGGE圖譜單一泳道上所有條帶的豐度，Ni為第i條帶的豐度；S是某樣品中所有條帶數(shù)目總和。最后采用UPGAMA算法進(jìn)行聚類分析。

1.5 序列測定與分析

用滅菌的手術(shù)刀切下主要的DGGE優(yōu)勢條帶，再采用OMEGA公司Poly-Gel DNA 提取試劑盒回收目的條帶。以2 μl回收產(chǎn)物為模板，以338F(CCTACGGGAGGCAGCAG)/518R和FR1(AICCATTCAATCGGTAIT)/FF390為引物分別進(jìn)行16S rDNA 和18S rDNA可變區(qū)序列的再擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接到PMD18-T載體上，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆，進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果采用DNAstar和Cluster軟件進(jìn)行分析，下載最相似的菌株序列作為系統(tǒng)發(fā)育樹的參考序列，然后采用MEGA軟件和Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展數(shù)(bootstrap)為1000。

圖1 酥油樣品16S rDNA可變區(qū)DGGE指紋圖Fig.1 16S rDNA DGGE fingerprints from butter samples

圖2 不同酥油樣品的細(xì)菌DGGE圖譜聚類結(jié)果Fig.2 Clustering analysis of bacterial DGGE patterns on different butter samples

2 結(jié)果與分析

2.1 拉薩市酥油細(xì)菌多樣性分析

2.1.1 拉薩市酥油細(xì)菌DGGE指紋圖譜分析 酥油細(xì)菌PCR-DGGE多樣性分析共得到不同優(yōu)勢條帶62條(圖1)。依據(jù)15個(gè)樣品間的戴斯系數(shù)，構(gòu)建不同樣品的細(xì)菌DEEG聚類圖(UPGMA)，結(jié)果表明：14和15號樣品的相似度最高，達(dá)到0.82；4和5號樣品的相似度為0.67；8和9號樣品的相似度為0.65；12號和13、14、15號樣品的相似度為0.61；10和11號樣品的相似度為0.54; 8、9號樣品和12、13、14、15號樣品的相似度為0.48；7、10、11號樣品和8、9、12、13、14、15號樣品的相似度為0.44；2號樣品和7、8、9、10、11、 12、13、14、15號樣品的相似度為0.34；3號樣品和4、5號樣品的相似度為0.32(圖2)。

根據(jù)電泳圖譜中樣品條帶數(shù)目及每個(gè)條帶的強(qiáng)度(灰度)，對各樣品中細(xì)菌多樣性指數(shù)(H)、均勻度(E)和豐富度(S)等指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果表明：1號樣本的細(xì)菌多樣性最高，其次為3、7、11、14號樣本，再次為2、5、6、12、15號樣本，4號樣本的細(xì)菌多樣性最低(圖3)。

圖3 拉薩地區(qū)不同酥油樣品的細(xì)菌Shannon-Wiener多樣性指數(shù)Fig.3 Bacterial Shannon-Wiener diversity index on different butter samples in Lhasa

2.1.2 酥油樣品中優(yōu)勢細(xì)菌16S rDNA序列分析及屬種鑒定 酥油樣品DGGE圖譜切膠共得到62條優(yōu)勢條帶，測序結(jié)果表明：拉薩地區(qū)酥油樣品中的62個(gè)優(yōu)勢細(xì)菌中37個(gè)為厚壁菌門(其中17個(gè)為乳球菌屬，11個(gè)為鏈球菌屬，6個(gè)為乳桿菌屬，2個(gè)為糞腸球菌屬，1個(gè)為Pilibacter termitis )；20個(gè)為變形菌門(其中12個(gè)為假單胞菌屬，4個(gè)為不動(dòng)桿菌屬，1個(gè)為希瓦氏菌屬，1個(gè)為拉烏爾菌屬，1個(gè)為克魯維菌屬，1個(gè)為Herminiimonas )；5個(gè)為擬桿菌門(其中3個(gè)為穩(wěn)桿菌屬，1個(gè)為黃桿菌屬，1個(gè)為Epilithonimonas)。由此判斷，拉薩地區(qū)酥油樣品中的優(yōu)勢細(xì)菌種群主要為乳球菌、假單胞菌、鏈球菌以及乳桿菌。

表2 酥油樣品優(yōu)勢細(xì)菌的序列比對

續(xù)表2 Continued table 2

樣品編號最相似菌種名稱登錄號相似度(%)Band37LactococcuspisciumNR＿043739 99Band38EnterococcusfaeciumNR＿102790 100Band39LactococcusplantarumNR＿118903 95Band40PseudomonaskuykendalliiNR＿118155100Band41AcinetobacterkyonggiensisNR＿11671499Band42LactobacillusacidophilusNR＿075045100Band43StreptococcussaliviloxodontaeNR＿126178 94Band44StreptococcusloxodontisalivariusNR＿126177 94Band45Lactobacillusdelbrueckiisubsp NR＿117076100Band46Lactococcuslactissubsp NR＿103918100Band47LactococcusraffinolactisNR＿118904 98Band48AcinetobacterjohnsoniiNR＿04497599Band49LactobacillusacidophilusNR＿075045100Band50LactobacilluspsittaciNR＿12581199Band51PseudomonascongelansNR＿028985 99Band52LactococcusraffinolactisNR＿044359 95Band53EmpedobacterfalseniigenomovarNR＿042430 98Band54KluyveraintermediaNR＿028802100Band55Streptococcusinfantariussubsp NR＿102799 99Band56StreptococcusagalactiaeNR＿102871 94Band57LactococcuslactisNR＿040955100Band58StreptococcusagalactiaeNR＿115728 95Band59StreptococcushongkongensisNR＿11797494Band60StreptococcusthermophilusNR＿074827100Band61Lactococcuslactissubsp CramoisyNR＿040954 100Band62LactococcustaiwanensisNR＿114327 94

2.2 拉薩市酥油真菌多樣性分析

2.2.1 拉薩市酥油真菌DGGE指紋圖譜分析 酥油真菌PCR-DGGE多樣性分析共得到不同優(yōu)勢條帶18條(圖4)。依據(jù)15個(gè)樣品間的戴斯系數(shù)，構(gòu)建出不同樣品的真菌DEEG聚類圖(UPGMA)表明：4號和10號樣品的相似度最高，達(dá)到0.81；3號和15號樣品的相似度為0.75；8號和13號樣品的相似度為0.72；5號和12號樣品的相似度為0.70；9號和11號樣品的相似度為0.62；7號和5、12號樣品的相似度為0.61；8、13號樣品和3、6、15號樣品的相似度為0.61；5、7、12號樣品和4、10號樣品的相似度為0.58；1號樣品和14號樣品的相似度為0.56；2號樣品和9、11號樣品的相似度為0.53；2、9、11號樣品和4、5、7、10、12號樣品的相似度為0.47；1、4號樣品和3、6、8、13、15號樣品的相似度為0.45；1、3、6、8、13、14、15號樣品和2、4、5、7、9 、10、11、12號樣品的相似度為0.40(圖5)。根據(jù)電泳圖譜中樣品條帶數(shù)目及每個(gè)條帶的強(qiáng)度(灰度)，對各樣品中真菌多樣性指數(shù)(H)、均勻度(E)和豐富度(S)等指標(biāo)分析表明：2號樣本的真菌多樣性最高，其次為1、6、15號樣本，再次為3、4、5、7、8、9、10、11、12、13號樣本，14號樣本的真菌多樣性最低(圖6)。

2.2.2 酥油樣品中優(yōu)勢真菌的18S rDNA序列分析及屬種鑒定 酥油樣品DGGE圖譜切膠共得到18條優(yōu)勢條帶，測序結(jié)果表明：拉薩地區(qū)酥油樣品中有18個(gè)優(yōu)勢真菌，包括8個(gè)假絲酵母屬，4個(gè)亞羅酵母屬，2個(gè)畢赤酵母屬，1個(gè)酵母菌屬，1個(gè)克魯維酵母菌屬，1個(gè)芽生菌屬， 1個(gè)Naumovozyma，且相似度都在98 %及以上。由此判斷，拉薩市酥油樣品中的優(yōu)勢真菌種群主要為酵母菌，其中44.4 %為假絲酵母，22.2 %為亞羅酵母，11.1 %為畢赤酵母。

圖4 酥油樣品18S rDNA可變區(qū)DGGE指紋圖Fig.4 18S rDNA DGGE fingerprints from butter samples

圖5 拉薩市不同酥油樣品中真菌DGGE圖譜聚類結(jié)果Fig.5 Clustering analysis of the fungi DGGE patterns on different butter samples

圖6 拉薩市不同酥油樣品的真菌Shannon-Wiener多樣性指數(shù)Fig.6 Fungi Shannon-Wiener Diversity index on different butter samples in Lhasa

3 討 論

酥油是西藏地區(qū)重要的傳統(tǒng)乳制品，其微生物的種類和數(shù)量直接影響酥油產(chǎn)品的風(fēng)味、品質(zhì)和安全性。本文采用PCR-DGGE分子生物學(xué)技術(shù)，研究分析了拉薩市酥油微生物的多樣性。從拉薩市15份酥油樣品中鑒定出62種細(xì)菌和18種真菌，酥油樣品中的優(yōu)勢細(xì)菌種群主要為乳球菌、假單胞菌、鏈球菌以及乳桿菌，優(yōu)勢真菌種群主要為酵母菌，其中44.4 %為假絲酵母、22.2 %為亞羅酵母、11.1 %為畢赤酵母。Shannon-Wiener多樣性指數(shù)分析表明，1號樣品的細(xì)菌多樣性最高，2號樣品的真菌多樣性最高，值得注意的是這2個(gè)樣品均來自拉薩市堆龍德慶縣羊達(dá)鄉(xiāng)。研究還發(fā)現(xiàn)，酥油微生物中能夠產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)的主要是乳酸菌和酵母菌，可以在新產(chǎn)品研發(fā)中有針對性地加以利用。然而，在酥油中發(fā)現(xiàn)的62種細(xì)菌中有2種是糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)，腸球菌普遍存在于自然界，易引起心內(nèi)膜炎，膽囊炎，腦膜炎，尿路感染及傷口感染等多種疾病，是一種主要的病原微生物，需要在今后的酥油產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管中加以重點(diǎn)關(guān)注，開展風(fēng)險(xiǎn)評估并研究污染控制技術(shù)。

表3 酥油樣品中優(yōu)勢真菌的序列比對分析結(jié)果

目前有關(guān)酥油微生物的研究較少，劉曉棠等[10]早期研究表明西藏地區(qū)酥油樣品中細(xì)菌總數(shù)合格率為54.3 %，大腸菌群的合格率為95.0 %，致病菌檢出率為3.3 %，霉菌檢出率為97.5 %，結(jié)核桿菌及布魯氏桿菌尚未檢出。張以芳等[11]從26份云南酥油中共分離到18種49株乳酸菌，并且大部分乳酸菌具有較好的產(chǎn)香產(chǎn)酸性能，乳酸菌是酥油中的優(yōu)勢種群，與本文研究吻合。劉文俊等[12]對西藏地區(qū)牦牛乳和乳制品中分離得到6屬22種213株乳酸菌株，其中乳桿菌屬(Lactobacillus)118株，占分離乳酸菌總數(shù)55.40 %；其次為明串珠菌屬(Leuconostoc)74株，占34.74 %；同時(shí)還分離到鏈球菌屬(Streptococcus)5株，占2.35 %；乳球菌屬(Lactococcus)8株，占3.6 %；腸球菌屬(Enterococcus)4株，占1.88 %；魏斯氏菌屬(Weissella)4株，占1.88 %。本研究中拉薩地區(qū)酥油樣品中的細(xì)菌主要優(yōu)勢種群為乳球菌屬、假單胞菌屬、鏈球菌屬及乳桿菌腸球菌屬等，與劉文俊等西藏地區(qū)牦牛乳和乳制品研究結(jié)果基本一致。王秋玲等[13]研究指出酥油中真菌種類主要為有益酵母菌，同時(shí)還從酥油樣品中分離得到金黃色葡萄球菌等病源微生物，而本文鑒定出的病原微生物主要為糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)，可能是由于金黃色葡萄球菌在酥油中含量較少，糞腸球菌含量較高，PCR-DGGE對含量較少微生物未能檢測到，金黃色葡萄球菌需要通過增菌過程大量繁殖后才能檢測到。

酥油有益微生物的多樣性，說明酥油不只是含有乳脂肪、蛋白、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)的食品，對此，藏民族在長期酥油食用中也積累了豐富經(jīng)驗(yàn)，比如，腹瀉病人、大病患者和孕婦生育后的恢復(fù)期，食用新鮮酥油養(yǎng)胃或滋補(bǔ)。酥油有益微生物多樣性，有利于腸道微生物平衡和機(jī)體正常代謝，提高宿主免疫功能[9]，成為有益微生物的重要來源。因此，酥油有別于其他油脂，更有別于植物氫化油，在傳統(tǒng)食品現(xiàn)代化中高度重視酥油的這一特征，甚至充分利用這一特點(diǎn)，開發(fā)以酥油為原料的營養(yǎng)健康功能食品，市場潛力很大。

4 結(jié) 論

拉薩市酥油樣品微生物的多樣性研究表明：酥油樣品中優(yōu)勢細(xì)菌種群主要為乳球菌、假單胞菌、鏈球菌以及乳桿菌，優(yōu)勢真菌種群主要為酵母菌，其中44.4 %為假絲酵母、22.2 %為亞羅酵母、11.1 %為畢赤酵母。本文對產(chǎn)自拉薩市的酥油樣品進(jìn)行了系統(tǒng)的微生物多樣性分析研究，上述研究結(jié)果對酥油有益微生物資源的開發(fā)利用與酥油產(chǎn)品的質(zhì)量安全、科學(xué)監(jiān)管與防控提供了重要的科學(xué)依據(jù)。

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