趙 波 趙 萍 關(guān)新明

膠質(zhì)瘤(glioma)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤，起源于神經(jīng)外胚層細(xì)胞，約占人類腦腫瘤的40%～60%，具有廣泛的侵襲性及低級(jí)別向高級(jí)別轉(zhuǎn)化的趨勢，手術(shù)中全切比較困難，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差，病人生存期短，死亡率高，治療困難，是1種嚴(yán)重影響人類健康的疾病[1-2]。胃泌素釋放肽(gastrin releasing peptide,GRP)作為1種新的腫瘤標(biāo)志物正逐漸應(yīng)用于臨床[3]。本研究通過檢測腦膠質(zhì)瘤患者GRP的表達(dá)水平變化，分析其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2016年1月在我院住院的膠質(zhì)瘤患者60例作為試驗(yàn)研究對(duì)象，男性30例，女性30例，年齡30～70歲，平均年齡(52.5±4.8)歲，包括Ⅰ級(jí)12例，Ⅱ級(jí)18例，Ⅲ級(jí)19例，Ⅳ級(jí)11例；同時(shí)取入組患者距離腫瘤組織5 mm處的瘤旁組織60例。正常對(duì)照組30例，包括男性15例，女性15例，年齡31～70歲，平均年齡(54.2±4.5)歲，均取自于顱腦損傷患者術(shù)中內(nèi)減壓而切除的額、顳葉腦組織。所有入組患者術(shù)前均未接受過放療、化療、免疫等抗腫瘤治療，均經(jīng)顯微手術(shù)全切除腫瘤。患者在性別、年齡等方面無明顯差異(P<0.05)，具有可比性。

1.2 試劑及器材

GRP ELISA試劑盒，GRP封閉液加一抗，兔抗鼠免疫組化二抗試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；離心機(jī)(上海飛鴿)；顯微鏡(日本Olympus)；酶標(biāo)儀(英國TECNA)；脫水機(jī)(日本TIYODA)；切片機(jī)(德國Leica)；計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(美國惠普)。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.3.1 ELISA法檢測入組患者血液中GRP含量 入組患者于術(shù)前、術(shù)后及預(yù)后過程中抽取空腹靜脈血，1 500 r/min離心10 min后吸取上清，保存于低溫冰箱中。計(jì)算板孔數(shù)；試劑盒常溫放置30 min；標(biāo)準(zhǔn)品稀釋；每個(gè)濃度均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，加樣；配液；洗滌；顯色；終止；酶標(biāo)儀以450 nm的波長處測量吸光值；繪制線性回歸方程，計(jì)算樣品濃度。

1.3.2 IHC法檢測組織中GRP的表達(dá) 福爾馬林液固定、脫水、透明；包埋、切片；熱修復(fù)；過氧化氫阻斷；正常山羊血清封閉；加一抗(濃度1∶100)50 μl靜置1 h；加二抗(濃度1∶100)50 μl 靜置10 min；顯色、終止；復(fù)染、分化；封片。

1.3.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) GRP陽性結(jié)果判定：細(xì)胞核不染色，胞膜或胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為陰性(-)；11%～25%為弱陽性(+)；26%～50%為陽性(++)；>50%為強(qiáng)陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ELISA法檢測入組患者血清中GRP含量

膠質(zhì)瘤組術(shù)前GRP含量為(1.25±0.14) ng/ml，均較正常對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；膠質(zhì)瘤組術(shù)后及預(yù)后期間GRP水平均較術(shù)前下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；具體結(jié)果見表1。

表1 ELISA法檢測入組患者血液中GRP含量

注：*為與正常對(duì)照組比較，P<0.05；#為與術(shù)前比較，P<0.05。

2.2 免疫組織化學(xué)法檢測入組患者腦組織中GRP的表達(dá)

膠質(zhì)瘤組中14例GRP強(qiáng)陽性表達(dá)，30例陽性表達(dá)，陽性率為73.3%，均較瘤旁組織、正常對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且瘤旁組織GRP陽性表達(dá)率較正常對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具體結(jié)果見表2。

表2 IHC法檢測入組患者腦組織中P53、VEGF表達(dá)情況/例

注：*為與瘤旁組織比較，P<0.05；#為與正常對(duì)照組比較，P<0.05。

2.3 膠質(zhì)瘤組GRP表達(dá)水平與其臨床病理特征的關(guān)系

GRP表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤病理類型、WHO分級(jí)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、生存時(shí)間有關(guān)(P<0.05)，與年齡、性別、PS評(píng)分無關(guān)(P>0.05)；對(duì)于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、分級(jí)為Ⅳ級(jí)者、出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、生存時(shí)間≤5年的膠質(zhì)瘤患者，GRP表達(dá)升高，具體結(jié)果見表3。

表3 GRP表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤臨床病理特征的關(guān)系/(例，%)

3 討論

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，其成人發(fā)病率約為6/10萬，5年生存率約為20%～30%，具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高死亡率、低治愈率的特點(diǎn)[4]。膠質(zhì)瘤預(yù)后差的主要原因在于膠質(zhì)瘤大多數(shù)呈浸潤性生長，與周圍腦組織邊界不清，手術(shù)難以全部切除，術(shù)后易復(fù)發(fā)，盡管采取了放療或化療等綜合治療措施，目前為止療效仍不夠理想[5]。GRP最早在1978年由McDonald等從豬的胃組織中分離出來的，具有促胃泌素分泌的作用，是有效的促分泌素或調(diào)節(jié)肽，由27個(gè)氨基酸組成，普遍存在于非胃竇組織、神經(jīng)纖維腦、肺組織的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中，通過自分泌、異常分泌、神經(jīng)內(nèi)分泌等方式作用于特異性的受體GRPR[6]。在本研究中，檢測膠質(zhì)瘤患者CRP的表達(dá)變化，分析其臨床意義。

在本研究中，抽取入組患者外周靜脈血檢測血清GRP含量，膠質(zhì)瘤組患者于術(shù)前的血清GRP水平高于正常對(duì)照組，而在術(shù)后、預(yù)后期間CRP水平較術(shù)前有所下降，但仍高于正常對(duì)照組。進(jìn)一步檢測入組患者腦組織中GRP的表達(dá)，膠質(zhì)瘤組患者的瘤組織中GRP陽性率顯著高于瘤旁組織、正常對(duì)照組，且瘤旁組織中GRP陽性表達(dá)率較正常對(duì)照組升高。這表明，在膠質(zhì)瘤患者的血清及腦組織中均存在GRP的表達(dá)水平升高。Flores對(duì)正常人腦組織和人腦膠質(zhì)瘤組織進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，正常人腦組織神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中未檢測到GRP的特異性受體GRPR表達(dá)，GRPR在人腦膠質(zhì)瘤組織中的陽性表達(dá)率為100%[7]。在腫瘤組織中，兩者結(jié)合后通過影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑刺激腫瘤的發(fā)生、增殖、血管形成及侵襲、轉(zhuǎn)移[8]。

本研究進(jìn)一步對(duì)入組膠質(zhì)瘤患者GRP的表達(dá)水平與性別、年齡、PS評(píng)分、病理類型、WHO分級(jí)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、生存時(shí)間等臨床病理特征進(jìn)行比較，GRP表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的病理類型、WHO分級(jí)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、生存時(shí)間有關(guān)，與年齡、性別、PS評(píng)分無關(guān)；對(duì)于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、分級(jí)為Ⅳ級(jí)、出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、生存時(shí)間≤5年的膠質(zhì)瘤患者，GRP的表達(dá)水平明顯升高。有實(shí)驗(yàn)指出，膠質(zhì)瘤組織GRP呈現(xiàn)高表達(dá)，隨著膠質(zhì)瘤惡性分級(jí)的增加，其表達(dá)強(qiáng)度也隨之增加。GRP通過GRPR發(fā)揮作用，除促進(jìn)生長、調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)和激素分泌外，也參與調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律、記憶、焦慮、恐懼反應(yīng)、并與炎癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、退行性病變、神經(jīng)精神性疾病、腫瘤相關(guān)[9]。GRP可能為與其特異性受體體GRPR結(jié)合，啟動(dòng)相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，刺激某些原癌基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯，抑制瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、新生血管生成、浸潤、轉(zhuǎn)移的發(fā)生，最終導(dǎo)致腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移[10]。

綜上所述，在膠質(zhì)瘤患者血清及組織中均存在GRP的高度表達(dá)，與膠質(zhì)瘤的病理類型、WHO分級(jí)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、生存時(shí)間有關(guān)，對(duì)于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、分級(jí)為Ⅳ級(jí)、出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、生存時(shí)間≤5年的膠質(zhì)瘤患者，GRP的表達(dá)水平明顯升高。GRP涉及腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)步驟，以GRP為靶點(diǎn)的靶向免疫治療、靶向化療、靶向分子生物治療都是有效的抗腫瘤手段。研究者們可進(jìn)一步深入探索，以GRP為靶點(diǎn)的各種抗腫瘤治療有望在臨床中得到應(yīng)用。

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