林通++張玉奇+李小悅

[摘要]目的 探討補(bǔ)中益氣湯對(duì)念珠菌感染小鼠肝臟線粒體功能的保護(hù)作用和機(jī)制。方法 40只雄性昆明小鼠經(jīng)環(huán)磷酰胺（CTX）預(yù)處理后腹腔注射白念珠菌混懸液，制作念珠菌感染小鼠模型，分成對(duì)照組（n=20）和試驗(yàn)組（n=20）。對(duì)照組給予抗真菌治療，試驗(yàn)組給予抗真菌聯(lián)合補(bǔ)中益氣湯治療，觀察兩組生存率、線粒體生成指標(biāo)（PGC-1α mRNA）、氮化應(yīng)激指標(biāo)（NO、總NOS、iNOS）和肝臟病理。結(jié)果 試驗(yàn)組生存率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（70% vs. 30%，P=0.011）。試驗(yàn)組PGC-1α mRNA顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；試驗(yàn)組氮化應(yīng)激指標(biāo)顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。光鏡下試驗(yàn)組小鼠肝臟肝竇充血較對(duì)照組減輕。結(jié)論 補(bǔ)中益氣湯通過抑制氮化應(yīng)激保護(hù)念珠菌感染小鼠肝臟線粒體功能，促進(jìn)肝細(xì)胞線粒體生成。

[關(guān)鍵詞]念珠菌感染；補(bǔ)中益氣湯；線粒體；氮化應(yīng)激

[中圖分類號(hào)] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）1（c）-0117-03

Protective effect of Buzhong Yiqi Decoction on liver mitochondrial function in mice infected by candida albicans

LIN Tong1 ZHANG Yu-qi2 LI Xiao-yue2

1.Family Planning Service Center，Maternal and Child Health Care Hospital of Pingyuan County，Guangdong Province，Pingyuan 514600，China；2.Department of Critical Care Medicine，the Second Affiliated Hospital，Guilin Medical College，Guangxi Zhuang Autonomous Region，Guilin 541199，China

[Abstract]Objective To discuss the protective effect of Buzhong Yiqi Decoction on liver mitochondrial function in mice infected by candida and its mechanism.Methods 40 male Kunming mice were given intraperitoneal injection of candida albicans suspension after pretreatment by CTX and then made into models infected by candida albicans and were randomly divided into the control group （n=20） and experimental group （n=20）.Mice in the control group were given Antifungal therapy，while mice in the experimental group were given antifungal drug combined with Buzhong Yiqi Decoction.The survival rate，mitochondriopoiesis index，nitrosative stress index and hepatic pathology were observed.Results Survival rate was significantly higher in the experimental group than that in the control group（70% vs. 30%，P=0.011）.The level of PGC-1α mRNA was significantly higher in the experimental group than that in the control group（P<0.05）.The nitrosative stress index was significantly lower in the experimental group than in the control group，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion of hepatic sinusoid observed by light microscope was lighter in the experimental group than that in the control group.Conclusion Buzhong Yiqi Decoction may protect the liver mitochondrial function and facilitate mitochondriopoiesis in mice infected by candida albicans via inhibition of nitrosative stress.

[Key words]Candida infection；Buzhong Yiqi Decoction；Mitochondria；Nitrosative stress

念珠菌感染病機(jī)特點(diǎn)為本虛標(biāo)實(shí)，邪盛正衰[1]。補(bǔ)中益氣湯為宋代李杲《內(nèi)外傷辨惑論》之方劑，具有補(bǔ)中益氣、升陽(yáng)舉陷之功，是臨床上治療脾虛證的經(jīng)典方劑[2]。研究表明，補(bǔ)中益氣湯可提高脾氣虛動(dòng)物模型免疫器官指數(shù)，有助于提高免疫功能[3]。念珠菌感染容易發(fā)展為多器官功能不全綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），其中肝臟是最常見的受損器官之一[4]。線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變參與了膿毒癥發(fā)生、發(fā)展的過程[5]。本研究主要探討補(bǔ)中益氣湯對(duì)念珠菌感染動(dòng)物模型肝臟線粒體的保護(hù)作用和可能機(jī)制。endprint

1對(duì)象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠共40只（雄性，體重20～25 g），由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[6][SCXK（粵）2009-0011]。實(shí)驗(yàn)開始前2 d予環(huán)磷酰胺預(yù)處理，劑量分別為200 mg/kg、100 mg/kg；實(shí)驗(yàn)開始后第4天予環(huán)磷酰胺200 mg/kg。白念珠菌（ATCC90028，沙保弱培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48 h）配制標(biāo)準(zhǔn)混懸液（1×109 cfu/ml），采用腹腔注射白念珠菌混懸液方法建立念珠菌感染動(dòng)物模型。

1.2主要儀器與試劑

參照2010年《中華人民共和國(guó)藥典》，中藥復(fù)方包括黃芪30 g，升麻6 g，柴胡6 g，邊條參10 g，炙甘草15 g，當(dāng)歸6 g，橘皮6 g，白術(shù)10 g。所有藥材均購(gòu)自廣州市藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為正品。生藥加適量水浸泡0.5～1.0 h，煎煮2次（1.5、1.0 h），合并濾液，然后將藥物濃縮至生藥1 g/ml，4℃保存以備用。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及處理[6]

雄性昆明小鼠40只隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組20只。對(duì)照組和試驗(yàn)組均給與抗真菌藥物灌胃治療[伊曲康唑口服液（西安楊森），50 mg/kg，q12 h，稀釋成1 ml溶液]。試驗(yàn)組同時(shí)給予補(bǔ)中益氣湯4 g/（kg·d）灌胃。對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃。取0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm腎組織勻漿，沙保弱培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行白念珠菌菌落計(jì)數(shù)。動(dòng)物模型建立后第7天處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。組織標(biāo)本采集后儲(chǔ)存于-80℃冰箱中。

1.4觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

實(shí)驗(yàn)第7天記錄兩組生存例數(shù)，計(jì)算生存率。RT-PCR檢測(cè)PGC-1α mRNA表達(dá)豐度。ELASA（南京建成生物工程研究所）檢測(cè)氮化應(yīng)激指標(biāo)（NO、總NOS、iNOS）。取肝臟組織0.2 cm×0.2 cm×0.3 cm，固定后切片，光鏡觀察肝臟形態(tài)學(xué)變化。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組小鼠生存率的比較

試驗(yàn)組第7天小鼠生存率為70%，顯著高于對(duì)照組的30%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.011）。

2.2兩組小鼠PGC-1α和氮化應(yīng)激指標(biāo)的比較

試驗(yàn)組小鼠PGC-1α mRNA顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；試驗(yàn)組小鼠氮化應(yīng)激指標(biāo)顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.3兩組小鼠光鏡病理的比較

對(duì)照組小鼠光鏡下可見肝竇充血、細(xì)胞腫脹、部分呈空泡樣改變，局部可見少量白細(xì)胞移行。試驗(yàn)組肝竇充血、細(xì)胞腫脹較對(duì)照組減輕，空泡樣改變較對(duì)照組減輕（圖1）。

3討論

近年來，念珠菌感染已占院內(nèi)感染的13.2%，越來越受到臨床重視[7]。本研究前期研究顯示，免疫功能低下參與念珠菌感染的發(fā)生和發(fā)展，提高免疫功能可以改善念珠菌感染小鼠7 d生存率。免疫防御是西醫(yī)范疇中對(duì)機(jī)體抵抗微生物侵襲這一重要生理功能的描述。在中醫(yī)范疇中，將這一生理功能表述為正氣防御外邪。衛(wèi)氣是肺、脾、腎功能協(xié)調(diào)旺盛的結(jié)果，可以發(fā)揮正氣防御外邪的作用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，衛(wèi)氣與腎、脾、肺有關(guān)，關(guān)鍵又在于脾[8]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，中醫(yī)脾與淋巴免疫功能密切相關(guān)[9]。《脾胃論》指出“內(nèi)傷脾胃，百病由生”。脾不僅主運(yùn)化水谷精微，為后天之本，且能行使防御機(jī)能[1]。念珠菌感染多因年老、久病、長(zhǎng)期臥床、外傷等原因致肺脾虧虛，痰濕、痰熱等外邪乖虛而入，肺失宣降、脾失健運(yùn)發(fā)所致[2]。故念珠菌感染病機(jī)特點(diǎn)為本虛標(biāo)實(shí)，邪盛正衰。補(bǔ)中益氣湯為宋代李杲《內(nèi)外傷辨惑論》之方劑，具有補(bǔ)中益氣、升陽(yáng)舉陷之功，是臨床上治療脾虛證的經(jīng)典方劑。研究表明，補(bǔ)中益氣湯可提高脾氣虛動(dòng)物模型免疫器官指數(shù)，有助于提高免疫功能[3]。

念珠菌感染容易并發(fā)多器官功能不全綜合征，其中肝臟是重要的靶器官[10]。線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變參與了膿毒癥發(fā)生、發(fā)展的過程[11]。膿毒癥早期，肝細(xì)胞線粒體即可出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能改變，是膿毒癥發(fā)展的重要啟動(dòng)環(huán)節(jié)；膿毒癥恢復(fù)期，線粒體損傷伴隨著新的線粒體蛋白的生成，是參與膿毒癥機(jī)體修復(fù)過程的重要表現(xiàn)[12]。

目前針對(duì)補(bǔ)中益氣湯治療脾虛動(dòng)物模型的研究?jī)H限于T淋巴細(xì)胞增殖能力和脾淋巴細(xì)胞抗氧化損傷[13]。本研究前期研究證實(shí)，免疫調(diào)節(jié)劑減輕念珠菌感染所致肝損傷與保持肝臟線粒體的完整性有關(guān)，但補(bǔ)中益氣湯對(duì)念珠菌感染小鼠肝臟線粒體功能的保護(hù)機(jī)制未明[14]。本研究中，試驗(yàn)組PGC-1α mRNA顯著高于對(duì)照組，提示補(bǔ)中益氣湯可以通過促進(jìn)念珠菌感染動(dòng)物模型肝細(xì)胞線粒體生成發(fā)揮對(duì)肝細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用。既往研究證實(shí)，蛋白酶抑制劑可以提高PGC-1α水平，并且呈劑量依賴性，提示肝細(xì)胞線粒體生物發(fā)生參與了念珠菌感染病理?yè)p害的過程。

線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷是膿毒癥器官功能損害的重要機(jī)制，大量動(dòng)物研究結(jié)果顯示細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)是線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷的主要原因之一[15-16]。細(xì)胞因子風(fēng)暴包括氧化應(yīng)激和氮化應(yīng)激。近來多項(xiàng)基礎(chǔ)研究顯示氮化應(yīng)激參與了膿毒癥線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷的全過程[17-18]。本研究中，試驗(yàn)組氮化應(yīng)激指標(biāo)顯著低于對(duì)照組，提示補(bǔ)中益氣湯可以通過抑制氮化應(yīng)激水平促進(jìn)念珠菌感染動(dòng)物模型肝細(xì)胞線粒體生物發(fā)生，降低氮化應(yīng)激程度與肝細(xì)胞保護(hù)作用相關(guān)。補(bǔ)中益氣湯與氮化應(yīng)激、肝細(xì)胞線粒體生物發(fā)生之間的量效關(guān)系尚待進(jìn)一步的探索研究。

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（收稿日期：2017-11-02 本文編輯：崔建中）endprint