王曉華，張玉娟

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067000)

子宮內(nèi)膜癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率及病死率呈上升趨勢[1]。子宮內(nèi)膜癌患者早期多表現(xiàn)為陰道異常出血，手術(shù)治療預(yù)后較好[2]。但晚期或復(fù)發(fā)性內(nèi)膜癌患者的預(yù)后仍較差，中位生存期不超過1年[3]。目前，針對腫瘤基因通路的分子靶向治療是研究的熱點[4]。Livin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成員，在人類胎盤組織以及大多數(shù)實體腫瘤細胞中特異性高表達，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，Livin在子宮內(nèi)膜癌組織中同樣異常高表達，并且與組織學(xué)分級和肌層浸潤有關(guān)。但是，關(guān)于Livin對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、侵襲及遷移能力的影響鮮有報道。2015年12月～2017年2月，我們通過靶向抑制Livin在子宮內(nèi)膜癌細胞中的表達，觀察Livin對細胞增殖、侵襲及遷移能力的影響，旨在為子宮內(nèi)膜癌的分子靶向治療提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞購自南京凱基生物有限公司；胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養(yǎng)基、PBS、胰酶購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；TRIzol購自美國Ambion公司；Takara RNA PCRTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；SYBR Green qPCR SuperMIX-UDG熒光定量試劑盒購自美國Invitrogen公司；細胞毒性-增殖檢測試劑盒(CCK-8試劑盒)購自中國北京莊盟生物公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；特異性小分子干擾RNA(Livin-siRNA)及陰性對照序列(Livin-NC)由廣州銳博公司設(shè)計合成。

1.2　細胞培養(yǎng)與分組處理

將Ishikawa細胞置于含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h將細胞均勻接種于6孔板，調(diào)整細胞密度為4×105/mL。按Lipofectamine 2000說明書配制轉(zhuǎn)染試劑。將細胞分為Livin-Si組、Livin-NC組和空白對照組，Livin-Si組轉(zhuǎn)染Livin-siRNA干擾序列，Livin-NC組轉(zhuǎn)染Livin-NC陰性對照序列，空白對照組加入10% FBS。轉(zhuǎn)染6 h后棄去原培養(yǎng)基，更換為含10% FBS的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3　細胞中Livin mRNA表達檢測

采用實時熒光定量PCR法。轉(zhuǎn)染后48 h取各組細胞，加入TRIzol試劑提取RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用SYBR Green qPCR SuperMIX-UDG熒光定量試劑盒進行目的基因Livin和內(nèi)參基因GAPDH的RT-PCR擴增反應(yīng)，目的基因Livin和內(nèi)參基因GAPDH的引物均由大連寶生物公司設(shè)計合成。Livin上游引物5′-ACGGAGCATGCCAAGTGGT-3′，下游引物5′-CTGCACACTGTGGACAAAGTCTCT-3′，擴增產(chǎn)物78 bp；GAPDH上游引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，擴增產(chǎn)物138 bp。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，95 ℃ 1 min、60 ℃ 30 s、95 ℃ 30 s進行熔解曲線分析。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.4　細胞增殖能力觀察

采用CCK-8法。取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞密度至4×104/mL，接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后進行細胞轉(zhuǎn)染，每組設(shè)5個復(fù)孔，同時設(shè)置調(diào)零孔，只加培養(yǎng)基不加細胞。于轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h分別加入CCK-8稀釋液20 μL(CCK∶無血清培養(yǎng)基=1∶1)，混勻，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h。使用酶標儀測定450 nm處吸光度OD值。

1.5　細胞侵襲能力觀察

采用Transwell小室實驗。應(yīng)用Corning的小室模型，將Matrigel基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基按1∶5比例混勻，每個小室100 μL均勻包被小室基底膜。Matrigel基質(zhì)膠凝固后，上室加入無血清培養(yǎng)基水化基底膜30 min。收集轉(zhuǎn)染48 h的Livin-Si組、Livin-NC組和空白對照組細胞，PBS洗2次后，0.25%胰酶消化，用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度至4×105/mL。每孔上室加入100 μL單細胞懸液，下室加入600 μL含20% FBS培養(yǎng)基，將小室放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)43 h。擦凈Matrigel基質(zhì)膠和上室的細胞，4 ℃預(yù)冷的甲醇固定30 min。用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗3遍；取下微孔濾膜，放到載玻片上，用二甲苯稀釋過的樹膠封片。顯微鏡下隨機觀察5個視野細胞數(shù)量計數(shù)，取平均值，實驗重復(fù)5次。

1.6　細胞遷移能力觀察

采用Transwell小室實驗。不用鋪Matrigel基質(zhì)膠，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時間為30 h，其余同Transwell小室侵襲實驗。

1.7　統(tǒng)計學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1　三組Livin mRNA表達比較

Livin-Si組、Livin-NC組和空白對照組Livin mRNA相對表達量分別為0.462±0.086、0.925±0.023、1.000±0.000。Livin-Si組Livin mRNA相對表達量較Livin-NC組和空白對照組降低(P均<0.01)。

2.2　三組細胞增殖能力比較

轉(zhuǎn)染后24 h各組細胞OD值比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)。轉(zhuǎn)染后48、72、96 h，Livin-Si組細胞OD值低于Livin-NC組和空白對照組(P均<0.01)。見表1。

表1　三組細胞增殖能力比較

注：與Livin-Si組同時點比較，*P<0.01。

2.3　三組細胞侵襲能力比較

Livin-Si組、Livin-NC組和空白對照組穿膜細胞數(shù)分別為(22.4±3.6)、(52.6±4.2)和(54.8±2.8)個，Livin-Si組穿膜細胞數(shù)較Livin-NC組、空白對照組減少(P均<0.01)。

終于那個人不走，她的手擺在金枝眼下。女人們也越集越多，把金枝圍起來。她好像在耍把戲一般招來這許多觀眾，其中有一個三十多歲的胖子，頭發(fā)完全脫掉，粉紅色閃光的頭皮，獨超出人前，她的脖子裝好顫絲一般，使閃光的頭顱輕便而隨意地在轉(zhuǎn)，在顫，她就向金枝說：

2.4　三組細胞遷移能力比較

Livin-Si組、Livin-NC組和空白對照組穿膜細胞數(shù)分別為(34.8±3.8)、(60.8±5.2)和(62.4±4.4)個，Livin-Si組穿膜細胞數(shù)較Livin-NC組、空白對照組減少(P均<0.01)。

3　討論

細胞增殖與凋亡失衡是惡性腫瘤形成的重要機制之一。Livin位于20號染色體q13.3，全長4.6 kB，包含7個外顯子和6個內(nèi)含子。Livin的高級結(jié)構(gòu)由4個α螺旋和一個反平行β折疊的氨基酸重復(fù)序列組成，此氨基酸重復(fù)序列稱為高度保守桿狀病毒IAP氨基酸重復(fù)序列，C端含有RING環(huán)指結(jié)構(gòu)域。Lopes等[7]研究證實，Livin在正常成人的大多數(shù)組織中不表達或較少表達，在人的胎盤組織、胚胎組織以及大多數(shù)實體腫瘤中特異性高表達。Ye等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Livin在前列腺癌組織中高表達，并通過調(diào)節(jié)細胞G1/S期促進細胞增殖，推測Livin可能在前列腺癌的發(fā)生及細胞增殖方面起重要作用。莊莉等[9]研究表明，抑制Livin基因可明顯抑制肺腺癌SPC-A1細胞的增殖能力并增加細胞對順鉑化療的敏感性。Vucic等[10]研究表明，Livin可明顯促進Jurkat T淋巴細胞增殖，抑制其凋亡，其抗凋亡作用明顯強于B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)。Crnkovic-Mertens等[11]在宮頸癌Hela細胞中利用小分子RNA特異性干擾Livin的表達，Hela細胞的生長明顯受到抑制。Temkin等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Livin在良性子宮內(nèi)膜組織中少量表達，在子宮內(nèi)膜癌組織中特異性高表達，并與組織學(xué)分級有關(guān)，與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性。本研究首先將Livin的小分子干擾RNA轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞，實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后Livin mRNA表達量降低，說明成功抑制Livin在Ishikawa細胞中的表達。CCK-8實驗結(jié)果顯示，干擾Livin表達后，Livin-Si組細胞缺乏指數(shù)生長特征，增殖能力明顯受到抑制。

Chung等[13]應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，通過免疫組織化學(xué)、RT-PCR、Western blotting技術(shù)檢測胃癌AGS和SNU638細胞中Livin的表達，發(fā)現(xiàn)干擾Livin后能顯著抑制胃癌細胞的遷移和侵襲能力。Myung等[14]研究Livin對大腸癌SW480和DK01兩種細胞生物學(xué)行為的影響時發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制Livin基因的表達，可顯著抑制兩種大腸癌細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移能力，而過表達Livin則可促進細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。Wang等[15]應(yīng)用小分子RNA干擾技術(shù)觀察肝癌HepG2細胞的增殖、遷移和侵襲能力，結(jié)果顯示敲除Livin后肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力均明顯受到抑制。本研究侵襲及遷移實驗結(jié)果顯示，干擾Livin表達后，與Livin-NC組、空白對照組比較，Livin-Si組穿膜細胞數(shù)減少，說明Livin在子宮內(nèi)膜癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用，干擾Livin表達可抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。

綜上所述，抑制Livin在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞中的表達，可明顯抑制細胞的增殖能力，減弱細胞的侵襲及遷移能力。Livin基因作為IAP家族中的一員，在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用，相信隨著研究的不斷深入，一定能為子宮內(nèi)膜癌的靶向治療開拓新的方向。

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