張敏，魏萌，李懔，李金玉

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院，江蘇淮安223300)

膿毒癥是感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，是危重患者的主要致死原因。膿毒癥最常見的致病菌為革蘭陰性菌，膿毒癥患者病理生理學(xué)的變化與革蘭陰性菌所產(chǎn)生的內(nèi)毒素所致的感染反應(yīng)有重要關(guān)系。對(duì)于膿毒癥的治療，雖然采用抗菌藥物及其他強(qiáng)力支持性措施，但由于一般不能有效中和、滅活內(nèi)毒素毒性或抑制其誘生的多種活性介質(zhì)，因此難以從根本上解決其防治問題。嚴(yán)重膿毒癥患者的病死率達(dá)25%～30%，發(fā)生膿毒性休克后，患者病死率高達(dá)50%～60%[1，2]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的最外層結(jié)構(gòu)，其主要化學(xué)成分為脂多糖(LPS)。LPS是由類脂、多糖、蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物，在膿毒癥的病理演變中具有極其重要的作用。LPS因富含磷酸基團(tuán)及羥基，在溶液中帶有負(fù)電荷[3～5]。聚乙烯亞胺(PEI)是最早用于基因轉(zhuǎn)染的陽(yáng)離子聚合物之一，PEI分子內(nèi)含有許多氨基，在生理pH下會(huì)發(fā)生質(zhì)子化，從而帶有正電荷，可以通過靜電作用與帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合。已有文獻(xiàn)報(bào)道，富陽(yáng)離子的PEI能夠與LPS結(jié)合，并且能夠吸附液體內(nèi)游離的LPS[6，7]。2015～2016年，我們采用LPS刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，觀察PEI對(duì)炎癥反應(yīng)的影響。

1　材料與方法

1.1　材料

小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞(Abelson鼠科白血病病毒誘導(dǎo)的白血病小鼠腹水中提取的單核巨噬細(xì)胞)購(gòu)于武漢大學(xué)，PEI-B25(美國(guó)Sigma公司)；TRIzol(美國(guó)Invitrogen公司)；氯仿(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；異丙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；LPS(美國(guó)Sigma公司)；焦炭酸二乙酯(美國(guó)sigma公司)；Alexa-LPS(美國(guó)Invitrogen公司)；DMEM高糖(美國(guó)Hyclone公司)；胎牛血清(美國(guó)Giboco公司)；兩步法RT-PCR試劑盒(Takara Biotechnology)；引物(Takara Biotechnology)；TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒(中國(guó)欣博盛公司)。

1.2　細(xì)胞培養(yǎng)與干預(yù)

將RAW264.7細(xì)胞加入含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基、5% CO2、37 ℃條件下傳代培養(yǎng)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，接種于6孔板內(nèi)，每個(gè)板內(nèi)細(xì)胞數(shù)約3×105/mL，每個(gè)孔內(nèi)含1.5 mL培養(yǎng)基。生長(zhǎng)過夜后，將細(xì)胞分為空白組、LPS組、LPS+PEI組?？瞻捉M用相同體積的培養(yǎng)基孵育細(xì)胞；LPS組加入10 ng/mL LPS，LPS+PEI組先加入10 ng/mL LPS，培養(yǎng)10 min后加入1 μg/mL PEI。

1.3　細(xì)胞內(nèi)TNF-αmRNA表達(dá)檢測(cè)

采用real-time PCR法。用TRIzol法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，并檢測(cè)其純度和濃度。以總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，特異性引物分別擴(kuò)增TNF-α和β-actin。TNF-α引物序列：上游5′-GGTGCCTATGTCTCAGCCTCTT-3′，下游5′-GCTCCTCCACTTGGTGGTTT-3′；β-actin引物序列上游5′-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′，下游5′-AGCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3′。將得到的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液加入到real-time PCR反應(yīng)體系中，配制10×反應(yīng)體系(即0.2 μL ROX，0.2 μL SYBR，0.2 μL引物前鏈，0.2 μL引物后鏈，3.4 μL水和1 μL cDNA)。將配好的反應(yīng)體系在PCR儀器上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，共循環(huán)40次。熔解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以β-actin為內(nèi)參，TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)水平由公式2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。

1.4　細(xì)胞上清液中TNF-α水平檢測(cè)

采用ELISA法。各組細(xì)胞培養(yǎng)4 h后，取上清液，按照ELISA試劑盒的說明，檢測(cè)各組上清內(nèi)TNF-α。按照操作說明書配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化抗體工作液和稀釋液、酶結(jié)合物工作液和稀釋液、PBS洗滌液。分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣本孔。在空白孔中加樣本通用稀釋液100 μL，其余相應(yīng)孔中分別各加入100 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和所檢測(cè)的標(biāo)本。36 ℃孵箱內(nèi)孵育90 min。PBS液洗板5次后，在空白孔內(nèi)加生物素化抗體稀釋液(100 μL/孔)，其余孔中各加入100 μL生物素化抗體工作液，36 ℃孵箱內(nèi)孵育60 min。PBS液體洗板5次后，空白孔中加入酶結(jié)合物稀釋液(100 μL/孔)，其余孔內(nèi)各加入100 μL酶結(jié)合物工作液，用封板膠封住反應(yīng)孔，孵箱內(nèi)36 ℃孵育30 min。PBS液體洗板5次后，每孔內(nèi)加入顯色底物(TMB)100 μL，放入36 ℃孵箱內(nèi)避光孵育15 min。每孔內(nèi)加入100 μL終止液，混勻后即刻用酶標(biāo)儀測(cè)量OD450值。

1.5　RAW264.7細(xì)胞對(duì)Alexa-LPS的吸附情況觀察

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞，分為Alexa-LPS組和Alexa-LPS+PEI組。Alexa-LPS組加入10 ng/mL Alexa-LPS；Alexa-LPS+PEI組加入10 ng/mL Alexa-LPS培養(yǎng)10 min后，再加入1 μg/mL PEI。孵育30 min后，棄培養(yǎng)基，加入PBS清洗，低溫離心5 min；棄上清液，加入200 μL PBS，制成細(xì)胞懸液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞的平均熒光光度值。

1.6　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1　各組細(xì)胞內(nèi)TNF-α mRNA表達(dá)水平比較

空白組、LPS組、LPS+PEI組細(xì)胞內(nèi)TNF-α mRNA表達(dá)水平分別為0.99±0.14、50.79±7.44、38.77±5.24。LPS組TNF-α mRNA表達(dá)水平較空白組升高(P<0.01)，LPS+PEI組較LPS組降低(P<0.05)。

2.2　各組細(xì)胞上清液中TNF-α水平比較

空白組、LPS組、LPS+PEI組細(xì)胞上清液中TNF-α水平分別為6.68±2.99、1 085.00±236.20、753.10±61.46。LPS組TNF-α水平較空白組升高(P<0.01)，LPS+PEI組較LPS組降低(P<0.05)。

2.3　LPS組和LPS+PEI組細(xì)胞平均熒光光度值比較

LPS組和LPS+PEI組的細(xì)胞平均熒光光度值分別為221.0±11.2、228.0±8.2，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3　討論

內(nèi)毒素的生物學(xué)活性多種多樣，在體內(nèi)的作用錯(cuò)綜復(fù)雜，參與了機(jī)體內(nèi)許多病理生理反應(yīng)過程。內(nèi)毒素進(jìn)入機(jī)體后，主要由單核/巨噬細(xì)胞識(shí)別、吸附。據(jù)報(bào)道，給大鼠靜脈注射放射性標(biāo)記的內(nèi)毒素后5 min，99%以上的內(nèi)毒素即迅速?gòu)难h(huán)中清除。免疫組化結(jié)果顯示，從循環(huán)中清除的內(nèi)毒素迅速分布到肝、肺、腎等組織的巨噬細(xì)胞內(nèi)。內(nèi)毒素及其代謝產(chǎn)物經(jīng)巨噬細(xì)胞代謝后可逐漸由膽道系統(tǒng)排泄。所以說，單核/巨噬細(xì)胞在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了極其重要的作用[8]。

內(nèi)毒素進(jìn)入機(jī)體內(nèi)，對(duì)機(jī)體所造成的影響主要包括以下幾個(gè)方面：①細(xì)胞水平：刺激單核/巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞等炎癥細(xì)胞合成、釋放一系列炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)失衡，從而造成細(xì)胞組織器官損傷。②免疫系統(tǒng)：導(dǎo)致固有免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞如CD4、CD8、T細(xì)胞、B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞數(shù)量下降，細(xì)胞上抑制性受體(如程序性細(xì)胞死亡受體)表達(dá)增多，同時(shí)抑制性細(xì)胞(如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和髓源性抑制性細(xì)胞)明顯升高。③凝血系統(tǒng)：激活凝血、纖溶系統(tǒng)，觸發(fā)彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)等反應(yīng)。④病理生理改變：發(fā)熱反應(yīng)、血壓降低、代謝改變和局部過敏反應(yīng)等[9]。目前認(rèn)為，這些效應(yīng)主要是由于LPS與巨噬細(xì)胞表面的受體結(jié)合后產(chǎn)生的刺激作用，促使炎癥信號(hào)由細(xì)胞外轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞合成、釋放大量細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)，從而造成機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)失衡。

LPS是由類脂、多糖、蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物，在結(jié)構(gòu)上分成三部分：外層為O-特異性多糖鏈，為細(xì)菌的特異性抗原；中層為核心多糖，為細(xì)菌的共同的抗原；內(nèi)層為類脂A，主要決定LPS的致病性，是LPS的生物活性中心。LPS在LPS結(jié)合蛋白LBP的運(yùn)輸下與CD14結(jié)合。CD14是一種55 kD的富含亮氨酸重復(fù)序列的糖蛋白，其在N端有一疏水口袋，該疏水口袋邊緣富陽(yáng)離子殘基，能容納磷酸化的脂質(zhì)A，從而與LPS結(jié)合。CD14是GPI錨定蛋白，并沒有細(xì)胞質(zhì)內(nèi)組分。為了將LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，CD14將LPS運(yùn)送到TLR4-MD-2復(fù)合物，LPS促進(jìn)TLR4-MD-2復(fù)合物二聚體的形成，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的進(jìn)一步傳導(dǎo)；LPS刺激RAW264.7細(xì)胞后，導(dǎo)致大量促炎因子的產(chǎn)生，如TNF-α、IL-6等，其中有代表性的就是TNF-α。大量炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷，出現(xiàn)膿毒性休克甚至死亡[10～13]。在炎癥早期積極地應(yīng)用抗炎藥物，能夠抑制RAW264.7細(xì)胞的促炎反應(yīng)，從而在一定程度上抑制全身炎癥反應(yīng)綜合征。所以，對(duì)嚴(yán)重膿毒癥或膿毒性休克更需要早期認(rèn)識(shí)、早期診斷，并在診斷明確后立即治療，只有這樣才能改善預(yù)后[14，15]。

PEI是富陽(yáng)離子的聚合物，常用于基因轉(zhuǎn)染、免疫佐劑、基因疫苗運(yùn)輸工具，能夠與LPS結(jié)合，吸附液體內(nèi)游離的LPS[16,17]。本研究結(jié)果顯示，LPS刺激巨噬細(xì)胞后，TNF-α在mRNA和蛋白水平均明顯升高，應(yīng)用PEI干預(yù)后，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α下降。表明在LPS刺激RAW264.7細(xì)胞后，及早應(yīng)用PEI能夠有效抑制促炎介質(zhì)的產(chǎn)生。富含陰離子的LPS能與富含陽(yáng)離子的PEI結(jié)合，但我們的實(shí)驗(yàn)顯示，在LPS孵育RAW264.7細(xì)胞10 min后加入PEI，與RAW264.7細(xì)胞結(jié)合的LPS數(shù)量并沒有減少，也就是說PEI并不是通過抑制RAW264.7細(xì)胞與LPS的結(jié)合來抑制炎癥反應(yīng)的程度。

綜上所述，PEI能夠在LPS刺激引起的炎癥反應(yīng)早期抑制炎癥反應(yīng)的程度，為臨床早期抗炎方案提供了新的思路，其具體作用機(jī)制及其在臨床上的可行性仍需要進(jìn)一步探討。

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