郭文斐，黃晶，雷連成

(1吉林大學(xué)第一醫(yī)院，長春130021；2吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院)

細菌性腦膜炎是好發(fā)于兒童的中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性感染性疾病，常由化膿性細菌感染所致，又稱為化膿性腦膜炎。引起細菌性腦膜炎常見的病原菌主要有腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌、B組流感嗜血桿菌、大腸桿菌K1、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)單核李斯特菌、肺炎克雷伯菌等。盡管預(yù)防細菌性腦膜炎的疫苗研制已取得了很大的進展，但細菌性腦膜炎在全球范圍內(nèi)仍有較高的發(fā)病率和病死率，并且幸存者中有50%左右會發(fā)生永久性神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[1]，如腦損傷、癲癇、失聰以及視力變化等。血腦屏障(BBB)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要屏障，對維持腦內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)定至關(guān)重要，BBB完整性的破壞是病原菌入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起細菌性腦膜炎的重要環(huán)節(jié)。近年來，關(guān)于細菌性腦膜炎發(fā)病的分子機制研究已有了長足的進展，本研究就病原菌破壞BBB完整性機制的研究進展作一綜述。

1　BBB的結(jié)構(gòu)與功能

BBB主要由腦的微血管內(nèi)皮細胞及其細胞間的緊密連接、完整的基膜、周細胞以及星形膠質(zhì)細胞終足圍成的神經(jīng)膠質(zhì)膜組成，其中腦微血管內(nèi)皮細胞在細菌性腦膜炎的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。腦微血管內(nèi)皮細胞與其他內(nèi)皮細胞的不同之處在于前者具有復(fù)雜的緊密連接結(jié)構(gòu)，缺乏細胞孔并且缺少跨膜轉(zhuǎn)運的囊泡，正常情況下異物難以通過屏障結(jié)構(gòu)進入腦組織。構(gòu)成緊密連接的蛋白主要包括閉合蛋白occludin、閉合蛋白claudin、細胞選擇性黏附分子等，它們通過胞質(zhì)蛋白與細胞骨架相連[2]。BBB獨有的這些特點有效阻止了有害物質(zhì)由血液進入腦組織，維持了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常生理狀態(tài)。

2　BBB在腦膜炎中的變化

盡管BBB的結(jié)構(gòu)緊密，但在某些情況下仍會有少數(shù)病原菌可以突破宿主細胞屏障到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起腦膜炎。根據(jù)腦組織的結(jié)構(gòu)推測，病原菌入侵的位置可能在脈絡(luò)叢、中樞神經(jīng)系統(tǒng)屏障或硬腦膜靜脈竇的蛛網(wǎng)膜絨毛處。其中，病原菌與BBB的相互作用最為重要。在1例爆發(fā)性紫癜患者的尸檢報告中發(fā)現(xiàn)，腦膜炎奈瑟菌通過與BBB的多種成分直接作用進入腦組織[3]。在大腸桿菌K1引起的新生兒腦膜炎的鼠模型中發(fā)現(xiàn)，病原菌主要定植在軟腦膜外的腦微血管內(nèi)皮細胞周圍[4]。細菌要想成功穿越BBB，需要滿足以下幾方面的條件：持續(xù)高濃度的菌血癥，細菌的黏附聚集，相關(guān)信號通路的激活等。病原菌黏附在腦微血管內(nèi)皮細胞表面后，可釋放出毒力因子，破壞內(nèi)皮細胞之間的緊密連接，或通過胞吞轉(zhuǎn)運作用直接進入內(nèi)皮細胞內(nèi)，使得BBB通透性增加，病原菌及其有害物質(zhì)更易進入腦組織。McLoughlin等[5]在感染金黃色葡萄球菌的人腦微血管內(nèi)皮細胞的體外模型中發(fā)現(xiàn)，病原菌可有效黏附在內(nèi)皮細胞表面，并使得BBB通透性增加。同時，機體的抗感染免疫開始發(fā)揮作用，吞噬細胞(如粒細胞和單核細胞/巨噬細胞)被刺激，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB被激活，腦組織發(fā)生一系列炎癥反應(yīng)。機體分泌的趨化因子(如CXCL8、CCL3、CCL2等[6])與其他代謝產(chǎn)物(如活性氧和氮物質(zhì)等)以及補體系統(tǒng)共同作用募集高度活化的多形核中性粒細胞(PMN)，于內(nèi)皮細胞的緊密連接處穿過BBB，導(dǎo)致腦脊液細胞增多。在大腸桿菌K1感染的研究中發(fā)現(xiàn)，病原菌在PMN和巨噬細胞中的存活和繁殖可導(dǎo)致血液中產(chǎn)生促炎細胞因子，其上調(diào)BBB上細胞內(nèi)黏附分子1的表達，更促進了PMN的浸潤[7]。此外，在大腸桿菌感染的新生小鼠的大腦中也觀察到了TNF-α和IL-1β水平的上升[8]。由此可見，抑制中性粒細胞的募集可以減少神經(jīng)元損傷，改善腦膜炎的臨床癥狀。所以對社區(qū)獲得性腦膜炎患者，在抗生素治療的同時通常聯(lián)合使用地塞米松，以保護大腦免受細菌裂解產(chǎn)物誘發(fā)的機體過度炎癥所致的損傷。

3　腦膜炎性病原菌破壞BBB的毒力因子

3.1　腦膜炎奈瑟菌

腦膜炎奈瑟菌表面有眾多的毒力因子，包括菌毛、外膜蛋白以及脂多糖等，能夠使其定植在宿主細胞表面，免受宿主體內(nèi)中性粒細胞、補體系統(tǒng)的吞噬作用。其中Ⅳ型菌毛(T4P)是重要的毒力因子。T4P是一種存在于多種革蘭陰性菌表面并由菌毛蛋白聚合形成的絲狀物。組成T4P的主要菌毛蛋白是PilE，除此之外還包括PilV、PilX和ComP，T4P通過孔蛋白PilQ穿過莢膜伸出到細菌表面[9]。Bernard等[10]利用人源化的小鼠模型清晰地展現(xiàn)了腦膜炎奈瑟菌黏附素PilE、PilV與人內(nèi)皮細胞表面受體CD147之間的相互作用。另外，腦膜炎奈瑟菌表面外膜蛋白Opa在內(nèi)皮細胞上的受體為癌胚抗原相關(guān)細胞黏附分子[11]。Opc與細胞外基質(zhì)成分玻連蛋白或纖維連接蛋白結(jié)合后，能夠靶向結(jié)合腦血管內(nèi)皮細胞上的同源受體α5β1整合素，從而參與細菌的黏附過程[12]。在腦膜炎奈瑟菌疫苗研制的過程中發(fā)現(xiàn)，腦膜炎奈瑟菌黏附素A可作為抗原用于B型腦膜炎奈瑟疫苗的制備。

3.2　肺炎鏈球菌

正常情況下，肺炎鏈球菌定植在人鼻咽部，在某些特殊情況下，肺炎鏈球菌可穿過呼吸道黏膜防御系統(tǒng)進入血液，隨血流播散進入腦組織。此過程中需要多糖莢膜、表面蛋白以及細胞壁成分的共同作用。細菌黏附素膽堿結(jié)合蛋白A(CbpA)與聚合免疫球蛋白結(jié)合受體(pIgR)互相作用，可引發(fā)細菌易位，穿過鼻咽上皮[13]。在腦微血管內(nèi)皮細胞上，CbpA與內(nèi)皮細胞表面的層連蛋白受體結(jié)合，可以介導(dǎo)細菌穿越基底膜[14]。另外有研究表明，肺炎鏈球菌神經(jīng)酰胺酶A以及血小板內(nèi)皮細胞黏附分子1(PECAM1)也參與了細菌黏附于BBB內(nèi)皮細胞這一過程[15,16]。首次報道的與肺炎鏈球菌黏附、侵襲和轉(zhuǎn)運有關(guān)的受體是血小板活化因子受體(PAFR)[17]，這是一種G蛋白偶聯(lián)受體，它的天然配體是磷脂血小板活化因子。Iovino等[18]認為，炎癥反應(yīng)激活了PAFR，然后通過上調(diào)pIgR和PECAM1的表達，促進細菌與內(nèi)皮細胞的結(jié)合，從而參與到肺炎鏈球菌的致病過程。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌菌毛的主要黏附素RrgA和膽堿結(jié)合蛋白PspC也可與pIgR和PECAM1受體結(jié)合，在菌血癥來源的腦膜炎模型和突變體小鼠中研究發(fā)現(xiàn)，使用針對pIgR和PECAM1受體的抗體，可預(yù)防肺炎鏈球菌進入腦組織以及腦膜炎發(fā)展[19]。

3.3　B型鏈球菌

B型鏈球菌通過跨細胞途徑進入微血管內(nèi)皮細胞，其參與BBB完整性破壞的主要毒力因子有脂磷壁酸、菌毛蛋白PilA、αC蛋白、鏈球菌纖維連接蛋白結(jié)合蛋白等。引起新生兒腦膜炎的高毒力致病株B型鏈球菌ST-17可編碼B型鏈球菌高毒性黏附素HvgA,能有效黏附在腸道上皮細胞或腦微血管內(nèi)皮細胞表面，介導(dǎo)病原菌的侵襲。現(xiàn)已證明，PilA可結(jié)合細胞外基質(zhì)(ECM)的組分膠原蛋白，增強B型鏈球菌附著于內(nèi)皮細胞上的能力，這一過程依賴中性粒細胞的浸潤，因為中性粒細胞的消耗可降低BBB的完整性，促進B型鏈球菌的滲透。此外，PilA膠原復(fù)合物可與腦微血管內(nèi)皮上的α2β1整合素結(jié)合，促進細菌附著和趨化因子釋放[20]。

3.4　大腸桿菌K1

大腸桿菌K1是引起新生兒腦膜炎的第二大病原菌，K1莢膜的表達是其致病的關(guān)鍵。參與大腸桿菌K1黏附侵襲過程的毒力因子有FimH、外膜蛋白A、脂蛋白NlpI、鞭毛等。這些毒力因子與其宿主細胞受體相互作用，可以激活許多宿主細胞相關(guān)信號蛋白，包括磷脂酰肌醇3-激酶、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3、RHO家族GTP酶、酪氨酸激酶表皮生長因子受體(EGFR)和蛋白質(zhì)激酶C等。最近研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌K1通過內(nèi)化形成空泡的方式進入內(nèi)皮細胞，EGFR的激活在細菌內(nèi)化中起關(guān)鍵作用[21]。IbeA也是大腸桿菌K1重要的毒力因子，其與受體NF-κB調(diào)節(jié)因子Vimentin結(jié)合后可增加病原體入侵和PMN募集，增加BBB通透性，在宿主防御腦膜炎感染中起著不利的作用[22]。

4　腦膜炎性病原菌破壞BBB的作用途徑

4.1　細胞旁途徑

腦微血管內(nèi)皮細胞間的細胞連接對于維持BBB完整性起著關(guān)鍵作用，有效阻止了細菌等外源物質(zhì)從細胞旁途徑進入腦組織。然而，許多腦膜炎病原菌可以通過釋放毒素或者干擾緊密連接蛋白的作用影響B(tài)BB的功能。例如，B型鏈球菌可以通過釋放穿孔毒素直接破壞BBB[23]。而腦膜炎奈瑟菌則是通過靶向作用緊密連接蛋白來破壞BBB的完整性。腦膜炎奈瑟菌黏附到內(nèi)皮細胞表面后，T4P亞基PilE和PilV與內(nèi)皮細胞β2-腎上腺素能受體相互作用，迅速激活宿主細胞信號傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致埃茲蛋白募集以及SRC激酶、皮動蛋白的激活，使得內(nèi)皮細胞的細胞膜向外突出包裹住病原菌，增加了病原菌與內(nèi)皮細胞表面黏附的面積。此外，病原菌黏附還誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白8的活化，其促進閉合蛋白的水解[24]。最終，細胞間的緊密連接被破壞，BBB通透性增加，腦膜炎奈瑟菌通過細胞旁途徑侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。研究表明，B型鏈球菌的細胞壁組分可誘導(dǎo)宿主內(nèi)皮細胞中轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail-1的表達，其可下調(diào)緊密連接蛋白的表達[25]，BBB完整性降低，這使得B型鏈球菌開啟了細胞旁路徑進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。此外，大腸桿菌侵襲人腦微血管內(nèi)皮細胞時，可通TLR2-MAPK-ERK1/2信號通路誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子A和Snail-1的上調(diào)，進而影響緊密連接蛋白的表達，導(dǎo)致BBB通透性增加[26]。

4.2　跨細胞途徑

大腸桿菌K1是通過跨細胞途徑穿過BBB的。胞吞作用是一個復(fù)雜的過程，其涉及從內(nèi)皮細胞頂端到基底外側(cè)的細胞移動，細菌與內(nèi)皮細胞頂端受體結(jié)合后，促進細菌的侵襲和易位，最終通過胞吐作用離開細胞。近年研究發(fā)現(xiàn)，一些腦膜炎病原菌可以通過改變細胞骨架結(jié)構(gòu)，以活菌的形式直接進入宿主細胞。Iovino等[27]在感染肺炎鏈球菌的小鼠腦血管中觀察到，細胞間連接分子VE鈣黏蛋白著色連續(xù)均勻，表明該細菌是通過轉(zhuǎn)胞吞作用而不是通過緊密連接的中斷來穿過BBB的。Cutting等[28]在電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，B型鏈球菌在宿主細胞中以空泡形式存在，表明B型鏈球菌也可以通過跨細胞途徑侵入腦組織。此外，有研究證明，大腸桿菌K1可觸發(fā)肌動蛋白介導(dǎo)的攝取途徑，刺激機體的胞吞作用，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用也在大腸桿菌K1的攝取中起間接作用[29]。到目前為止，雖然在顯微鏡下觀察到了許多細菌內(nèi)化的現(xiàn)象，但是細菌內(nèi)化的機制目前尚不明確，有待進一步研究。

5　展望

盡管抗生素的應(yīng)用和疫苗的研發(fā)已取得了較大進展，但是細菌性腦膜炎仍然是威脅全球人類健康的重大疾病，特別是在嬰幼兒、老年人和免疫功能低下的人群中，發(fā)病率和病死率仍較高?？剐跃甑某霈F(xiàn)(如大腸桿菌和肺炎鏈球菌)、表型的異質(zhì)性(如腦膜炎球菌)、有效疫苗的缺乏(如B型鏈球菌)等是我們目前面臨的重大難題。關(guān)于宿主-病原菌相互作用的分子機制方面目前已取得了重大進展，掌握病原菌開放BBB的常用途徑，有助于細菌性腦膜炎的預(yù)防和靶向治療。此外，對于如何使藥物穿過BBB治療相應(yīng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病仍然是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的一個難題，因此研究病原菌的信號傳導(dǎo)途徑對藥物的靶向運輸具有重要的臨床意義。然而，目前所掌握的大部分?jǐn)?shù)據(jù)都是體外研究的結(jié)果，對于體外試驗與病原菌體內(nèi)活動的相關(guān)性仍然存在疑問，仍然需要使用人源化的動物模型來進一步探究腦膜炎病原菌在體內(nèi)的致病活動，為腦膜炎相關(guān)疫苗的研發(fā)和治療提供理論基礎(chǔ)。

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