孫景春，師慶紅，石 宇，宋麗娜

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗科，吉林 長春130033)

蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3(PDIA3)，也被稱為ERp57,是一種58kD的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白，是屬于PDI家族的硫醇氧化還原酶伴侶蛋白[1]。該分子涉及多種細(xì)胞功能，包括新合成的蛋白質(zhì)的折疊和主要組織相容性復(fù)合物I(MHC-I)的裝配[2,3]。在人類的卵巢癌、乳腺癌、子宮癌、肺癌、胃癌和前列腺癌中都有PDIA3的表達(dá)[4-6]。本研究對PIDA3在大腸癌組織中的表達(dá)情況及其在細(xì)胞內(nèi)的定位進(jìn)行初步探討。

1 材料和方法

1.1研究對象

本試驗研究對象為2015 年10月至2016年12月期間在吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院手術(shù)治療的大腸癌患者，共計20例。取其術(shù)中切除的癌組織及癌旁腸黏膜組織標(biāo)本(距癌組織均大于10 cm)，液氮速凍后備用。所有腫瘤組織標(biāo)本術(shù)后經(jīng)病理學(xué)證實均為TNMⅢ期腺癌。

1.2試劑與儀器

蛋白定量試劑盒購自BIO-RAD公司；測序級胰酶、RNA酶、DNA酶、兔抗人PDIA3多克隆抗體、HRP-羊抗兔IgG和考馬斯亮藍(lán)G-250購自美國西格瑪公司；蛋白抽提試劑盒購自CW Bio公司；免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；其他化學(xué)試劑購自北京化學(xué)試劑廠。

Agilent 1200高效液相色譜儀購自美國安捷倫公司；LTQXL離子肼質(zhì)譜儀購自美國賽默飛公司。

1.3方法

1.3.1將組織樣本從液氮中取出，剪碎，在液氮中研磨。提取組織樣本的總蛋白質(zhì)。用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)測定上清液中的蛋白質(zhì)濃度。操作過程按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2制備組織樣本的蛋白質(zhì)酶解多肽混合物，采用二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行檢測分析。離子肼質(zhì)譜儀的檢測范圍為質(zhì)核比400-2 000 amu，本研究采用數(shù)據(jù)依賴的方式進(jìn)行次二級質(zhì)譜掃描。

1.3.3數(shù)據(jù)庫檢索 通過Bioworks 3.3.1 SP1軟件包用SEQUEST算法對有10個以上離子信號且強度在10個單位以上的譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索。鑒定出相關(guān)多肽和蛋白質(zhì)。

檢索參數(shù)為：半胱氨酸修飾為+57，完全酶切肽段，可以有兩個誤切位點，多肽質(zhì)量誤差范圍為3 Da。篩選參數(shù)為：①Rsp=1。②假陽性率為1%時，ΔCn≥0.19，多肽為單電荷時，Xcorr=2.2；多肽為雙電荷時，Xcorr=2.5；多肽為三電荷時，Xcorr=2.9。

1.3.4免疫組化法檢測大腸癌組織中PDIA3的表達(dá)情況 按試劑盒說明書操作。陰性對照用PBS緩沖液代替PDIA3一抗；已明確PDIA3蛋白陽性表達(dá)的切片作為陽性對照。采用奧林巴斯BX51顯微成像系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果

2.1大腸癌與癌旁組織的鑒定數(shù)據(jù)

經(jīng)過對大腸癌組織總蛋白酶解多肽混合物進(jìn)行檢測分析，共獲得696個蛋白質(zhì)的鑒定材料；相應(yīng)配對的癌旁組織共獲得428個蛋白質(zhì)的鑒定材料。

通過譜圖數(shù)來評價每個蛋白質(zhì)的豐度，將腫瘤組織與癌旁組織中蛋白譜圖數(shù)的比值≥1，譜圖數(shù)的差值≥72的蛋白鑒定為差異表達(dá)的蛋白。結(jié)果顯示有顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì)共18個，其中大腸癌組織中表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)共11個；在大腸癌組織中表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)共7個。其中目標(biāo)蛋白PDIA3為在大腸癌組織中上調(diào)表達(dá)的蛋白。

2.2免疫組化結(jié)果

為進(jìn)一步研究PDIA3在組織中的表達(dá)情況及在細(xì)胞內(nèi)的定位，我們采用了免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行研究。陽性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)為：細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)清晰棕黃色或棕褐色顆粒。如圖1所示，PDIA3主要表達(dá)在胞漿，有的在胞漿和胞膜同時表達(dá)。

圖1 PDIA3在大腸癌組織中的表達(dá)(╳200)

3 討論

本研究運用二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，分析鑒定了TNMⅢ期大腸癌及配對癌旁組織的蛋白表達(dá)情況，共得到了18個差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，這是從蛋白組學(xué)的層面對大腸癌進(jìn)行研究，是近年來腫瘤研究方面一種較前沿的技術(shù)[7]。本研究得到了大量的組學(xué)數(shù)據(jù)，除本實驗的目標(biāo)蛋白外，還有許多數(shù)據(jù)值得在后續(xù)研究中深入分析，綜合這些數(shù)據(jù)有望在篩選大腸癌的腫瘤標(biāo)志物方面有所突破。

本實驗的目標(biāo)蛋白PDIA3在各種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用以及它的含量對腫瘤預(yù)后及治療效果的影響也是近年來研究者們關(guān)注的熱點。有研究發(fā)現(xiàn)PDIA3對肝癌細(xì)胞的增殖有重要的調(diào)節(jié)作用，并與肝癌的預(yù)后密切相關(guān)[8]。PDIA3可調(diào)節(jié)細(xì)胞的侵襲力，并作為宮頸癌的預(yù)后標(biāo)志物[9,10]。PDIA3的表達(dá)還影響胃癌的預(yù)后[11]。PDIA3還可通過調(diào)節(jié)STAT3活性影響喉癌細(xì)胞對放療的抗性，并作為喉癌的預(yù)后指標(biāo)[12]。腫瘤細(xì)胞中PDIA3的消耗還將抑制其增殖并增加對電離輻射和化療藥的敏感性，因此，PDIA3將有望成為新的抗癌治療靶點[13]。此外，PDIA3對大腸癌生物學(xué)行為的影響以及是否有望成為一種新的大腸癌的腫瘤標(biāo)志物仍需我們在后續(xù)工作中深入研究。

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