吳相佚，宋馨然，劉斯，李天歌，毛學(xué)英

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083)

0　引言

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在有害刺激條件下產(chǎn)生活性氧自由基，使機(jī)體處于易損狀態(tài)，從而引起一系列疾病，如腫瘤、老年性癡呆癥、炎癥、動脈粥樣硬化、糖尿病等[1-2]。尋求天然、安全、高效的食源抗氧化功能因子，改善氧化應(yīng)激和抗氧化防御之間的不平衡，營養(yǎng)干預(yù)氧化損傷具有重要意義。天然乳源抗氧化肽可通過清除自由基、螯合金屬離子或直接消除活性氧等方式發(fā)揮其功能作用，從而提高機(jī)體的抗氧化能力，緩解氧化應(yīng)激狀態(tài)[3-4]。α-乳白蛋白作為乳清蛋白中的一種重要組分，不僅能為機(jī)體提供豐富的營養(yǎng)，而且富含多種生物活性序列。因此，本研究研究α-乳白蛋白酶解物的體外抗氧化作用以及對HepG2肝細(xì)胞內(nèi)ROS的抑制作用，旨在為α-乳白蛋白酶解物作為功能性原料提供科學(xué)依據(jù)。

1　實驗

普通化學(xué)試劑：氫氧化鈉、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36.5%濃鹽酸、冰醋酸、十二烷基硫酸鈉（SDS）、二水合磷酸二氫鈉（N aH2PO4·2H2O）、磷酸氫二鈉（N a2HPO4）、無水乙醇、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的TNBS溶液、2,2-聯(lián)氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）、菲啰嗪一鈉鹽、30%過氧化氫、鄰二氮菲等。

1.1　材料與儀器

1.1.1材料

α-乳白蛋白（Alpha-Lactalbumin），MEM高糖培養(yǎng)基，胎牛血清，青鏈霉素雙抗溶液（100×），非必需氨基酸（100×），0.25%胰蛋白酶（含 EDTA），DCFH-DA。

1.1.2儀器

TGL-20M型低溫高速離心機(jī)，LGJ-12型真空冷凍干燥機(jī)，UF/UVPL5124型超純水機(jī)，MCO-17AC型二氧化碳培養(yǎng)箱，iM arkTMMicroplateReader酶標(biāo)儀，ZDX 35BI型高壓滅菌鍋，DK-98-Ⅱ2KW型超凈工作臺，QL-861型旋渦混合器，UV-2600型紫外可見分光光度計，DK-8B型電熱恒溫水浴鍋，BS124s型分析天平，L2102型電子天平，F(xiàn)E20型pH計。

1.2　方法

1.2.1α-乳白蛋白堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的制備

稱取10 gα-乳白蛋白，制成質(zhì)量濃度為50 g/L的蛋白質(zhì)溶液。按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%酶與底物比加入蛋白酶水解。水解結(jié)束時于85℃條件下加熱20 min滅酶以終止反應(yīng)，轉(zhuǎn)速為4 000 r/min離心后棄沉淀，將上清液冷凍干燥后得到α-乳白蛋白酶解物。

1.2.2ABTS法測定抗氧化活性

將5 mL濃度為7 mmol/L的ABTS溶液和88μL濃度為140 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合，在室溫、避光條件下靜置過夜，形成ABTS儲備液。使用前用pH值為7.4的PBS緩沖液稀釋40～50倍，使其在734 nm波長下的吸光度為0.70±0.02，即得到ABTS工作液[5]。取2 mL的ABTS工作液，加入20μL酶解物樣品的PBS溶液，震蕩10 s以充分混合，靜置5min，于734 nm處測定其吸光值A(chǔ)r?？寡趸钚詾?/p>

式中：Ai為ABTS工作液初始的吸光值；Ab為空白對照（PBS緩沖液）的吸光值。

1.2.3Fe2+合能力的測定

取2 mL酶解物樣品溶液，加入濃度為2 mmol/L的FeSO4溶液50μL，濃度為0.5 mm o l/L菲啰嗪溶液1 mL，空白組用2 mL去離子水替代酶解物樣品溶液，40℃水浴10min，于562 nm處測定吸光值。

式中：A0為空白組的吸光度；A為樣品組的吸光度。

1.2.4羥自由基清除能力的測定

表1　羥自由基清除能力的測定方法 mL

按照表1所列順序依次向試管中加入試劑，38℃反應(yīng)50 min，反應(yīng)結(jié)束后于波長536 nm處分別測定吸光度。羥自由基清除率（D）為

1.2.5HepG2細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞在培養(yǎng)瓶貼壁面積達(dá)到80%～90%時開始傳代，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS沖洗殘留培養(yǎng)液，加入0.25%胰蛋白酶消化后將胰酶吸棄，加入新鮮培養(yǎng)基不斷吹打平皿底壁，使細(xì)胞均勻分散重懸，然后接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.6DCFH-DA測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平[6]

細(xì)胞接種至96孔板，濃度為2×104/mL，每孔接種200μL。加入不同濃度的α-乳白蛋白酶解物，加入濃度為400μm o l/L的H2O2溶液處理細(xì)胞。處理結(jié)束后，吸出培養(yǎng)基，避光加入150μL熒光探針DCFH-DA溶液，37℃下避光孵育60min，孵育結(jié)束后，使用熒光酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為530 nm。

1.2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計

結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。統(tǒng)計分析均采取版本為17.0的SPSS軟件進(jìn)行（SPSS Inc.,Chicago,1L）。當(dāng)多組數(shù)據(jù)間進(jìn)行顯著性分析時，使用單因素方差分析（one way ANOVA）伴隨Duncan多重比較，當(dāng)P＜0.05時認(rèn)為差異顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1　α-乳白蛋白酶解物的Fe2+合能力

采用菲啰嗪法測定α-乳白蛋白酶解物的Fe2+螯合能力，根據(jù)體系顏色的變化即可測定樣品的Fe2+螯合能力[7]，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，在α-乳白蛋白酶解物質(zhì)量濃度為0.25～2.0 g/L時，α-乳白蛋白酶解物顯示出較強(qiáng)的Fe2+螯合能力，但弱于陽性對照EDTA（P＜0.05）。隨著α-乳白蛋白酶解物濃度的增加，其Fe2+螯合能力也逐漸增加，呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)。當(dāng)α-乳白蛋白酶解物質(zhì)量濃度為2.0 g/L時，其Fe2+螯合率達(dá)到65.73%±2.60%。

圖1　α-乳白蛋白酶解物的Fe2+合能力

2.2　α-乳白蛋白酶解物的ABTS自由基清除能力

ABTS自由基清除能力被廣泛作為測定生物樣品的總抗氧化能力的指標(biāo)之一。具有抗氧化的物質(zhì)與ABTS自由基反應(yīng)后使其溶液褪色，特征吸光度降低，吸光度越低，表明所檢測物質(zhì)的總抗氧化能力越強(qiáng)[8]。由圖2可以看出，在ABTS測試體系中，α-乳白蛋白酶解物質(zhì)量濃度在0.25～2.0 g/L的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，ABTS自由基清除率顯著增加，呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)，但弱于陽性對照VC組（P＜0.05）。當(dāng)α-乳白蛋白酶解物質(zhì)量濃度為2.0 g/L時，ABTS自由基清除率達(dá)到66.81%±6.23%。

圖2　α-乳白蛋白酶解物的ABTS自由基清除能力

2.3　α-乳白蛋白酶解物的羥自由基清除能力

羥自由基（·OH）屬于體內(nèi)最活潑的活性氧。利用Fenton反應(yīng)來引發(fā)產(chǎn)生羥自由基，羥自由基氧化水楊酸得到2,3-二羥基苯甲酸，用其在510 nm處的吸光值表示·OH的多少[9]。由圖3可以看出，在0.25～2.0 g/L的α-乳白蛋白酶解物質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其羥自由基清除能力顯著增加，呈質(zhì)量濃度依賴效應(yīng)，當(dāng)α-乳白蛋白酶解物質(zhì)量濃度為2.0 g/L時，其羥自由基清除率為52.51%±3.63%（P＜0.05）。

圖3　α-乳白蛋白酶解物的羥自由基清除能力

2.4　α-乳白蛋白酶解物對細(xì)胞內(nèi)的清除作用

測定α-乳白蛋白酶解物對H2O2損傷H epG 2細(xì)胞內(nèi)ROS濃度的影響，結(jié)果如圖4所示。與正常對照組相比，H2O2可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著上升（P＜0.05）。與H2O2單獨(dú)處理組相比，隨著α-乳白蛋白酶解物干預(yù)濃度的升高，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低（P＜0.05），且呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)。當(dāng)干預(yù)質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 g/L時，α-乳白蛋白酶解物對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平上升的抑制率高達(dá)78.61%。α-乳白蛋白酶解物本身對于細(xì)胞內(nèi)的ROS生成量沒有顯著的影響作用。

圖4　α積-的乳影白響蛋白酶解物對H 2O 2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS蓄

3　討論

自由基是需氧生物體內(nèi)，通過正常的氧化代謝活動所產(chǎn)生的[10]。自由基在機(jī)體內(nèi)的產(chǎn)生是不可避免的，但在機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)以及抗氧劑作用下能夠被不斷地清除，在生理情況下自由基可維持在有利無害的極低水平。但當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，自由基就會攻擊人體內(nèi)的大分子物質(zhì)如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，破壞其結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生[11]。天然抗氧化肽具有天然、安全、易吸收、副作用小等特點，可通過清除自由基、螯合金屬離子或直接消除活性氧等方式發(fā)揮其功能作用，此外，能夠提高細(xì)胞中的抗氧化酶活力，清除過量ROS的生成，降低脂質(zhì)過氧化損傷水平，從而提高機(jī)體的抗氧化能力，緩解氧化應(yīng)激狀態(tài)[12]。Li[13]等從山羊奶酪蛋白酶解物中分離鑒定出五種新型抗氧化肽，其肽段組成分別為Val-Tyr-Pro-Phe，Phe-Gly-Gly-Met-Ala-Hi，Phe-Pro-Tyr-Cys-Ala-Pro，Tyr-Val-Pro-Glu-Pro-Phe，Tyr-Pro-Pro-Tyr-Glu-Thr-Tyr，具有良好的自由基清除能力、Fe2+結(jié)合能力及降低脂質(zhì)過氧化水平的能力。乳清蛋白酶解物對于對乙酰氨基酚造成的肝臟氧化應(yīng)激損傷具有較好的保護(hù)與治療作用，它可通過增加肝細(xì)胞總抗氧化能力及抗氧化酶的活性來發(fā)揮其活性功能[14]。此外，乳清蛋白酶解物可降低D-半乳糖對小鼠造成的急性氧化應(yīng)激損傷，維持小鼠體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)的平衡[15]。

H2O2是一種重要的活性氧，其本身并不具有自由基的性質(zhì)，但它極易透過細(xì)胞膜，引發(fā)脂質(zhì)氧化、導(dǎo)致生物大分子損傷，是建立細(xì)胞氧化損傷的常用物質(zhì)之一，廣泛用于成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞等細(xì)胞模型中[16]。乳蛋白是一種常見的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，國內(nèi)外研究者已利用酶解、發(fā)酵等方式從酪蛋白和乳清蛋白中提取到具有抗氧化活性的生物肽。牛乳酪蛋白酶解物經(jīng)過濾分級后得到的低分子量組分能夠通過增加肝細(xì)胞抗氧化酶活力及改善細(xì)胞凋亡來緩解H2O2誘導(dǎo)的H epG 2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[17]。乳清蛋白酶解物對H2O2誘導(dǎo)的PC 12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有良好的抑制作用，通過抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧的聚集等來發(fā)揮抗氧化作用[18]。酪蛋白糖巨肽酶解物具有較好的羥自由基清除能力、過氧化氫清除能力、Fe2+螯合能力和鐵還原能力，并可以通過降低巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS生成，提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力來緩解H2O2誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞細(xì)胞凋亡和脂質(zhì)過氧化損傷[19]。

本研究表明α-乳白蛋白酶解物具有良好的體外抗氧化能力，能有效緩解H2O2誘導(dǎo)的H epG 2細(xì)胞內(nèi)ROS的過量積累，推測其原因是α-乳白蛋白酶解后產(chǎn)生發(fā)揮抗氧化作用的肽段，這些肽段能淬滅部分H2O2在細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)生的氧自由基，緩解了自由基對細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化損傷，進(jìn)而保護(hù)了細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)。

4　結(jié)論

α-乳白蛋白酶解產(chǎn)物具有良好的抗氧化活性，當(dāng)其濃度為2.0 m g/mL時，其Fe2+螯合率、ABTS清除率、羥自由基清除率分別達(dá)到65.73%±2.60%，66.81%±6.23%和52.51%±3.63%。此外，α-乳白蛋白酶解物能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的HepG 2細(xì)胞內(nèi)ROS的過量生成，從而緩解氧化損傷。研究結(jié)果為乳源生物活性肽研發(fā)提供了一定的科學(xué)依據(jù)。課題組將通過SephadexG-25凝膠過濾和RP-HPLC對α-乳白蛋白酶解物進(jìn)一步分離，采用LC-MS/MS鑒定活性肽的氨基酸序列。

參考文獻(xiàn)：

[1]ZHU R,WANG Y,ZHANG L,et al.Oxidative stress and liver disease[J].Hepatology Research,2012,42(8):741-749.

[2]SAVU O,SUNKARI V G,BOTUSAN IR,et al.Stability of mitochondrial DNA against reactive oxygen species(ROS)generated in diabetes[J].Diabetes/Metabolism Research and Reviews,2011,27(5):470-479.

[3]POWER O,JAKEMAN P,FITZGERALD R J.Antioxidative peptides:enzymatic production,in vitro and in vivo antioxidant activity and potential applications of milk-derived antioxidative peptides[J].Amino Acids,2013,44(3):797-820.

[4]PIHLANTO A.Antioxidative peptides derived from milk proteins[J].International Dairy Journal,2006,16(11):1306-1314.

[5]RE R,PELLEGRINI N,PROTEGGENTE A,et al.Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay[J].Free Radical Biology And Medicine,1999,26(9):1231-1237.

[6]WANG H,JOSEPH J.Quantifying cellular oxidative stress by dichlorofluorescein assay using microplate reader[J].Free Radical Biology and Medicine,1999,27(5-6):612-616.

[7]GUO L,HARNEDY P A,O'KEEFFEM B,et al.Fractionation and identification of Alaska pollock skin collagen-derived mineral chelating peptides[J].Food Chemistry,2015,173:536-542.

[8]MIRZAEIA M,MIRDAMADIB S,EHSANIC M R,et al.Antioxidant,ACE-Inhibitory and antibacterial activities of Kluyveromyces marxianus protein hydrolysates and their peptide fractions[J].Functional Foods in Health and Disease,2016,6(7):425-439.

[9]ZHAO J,XIONG Y L,MCNEAR D H.Changes in Structural Characteristics of Antioxidative Soy Protein Hydrolysates Resulting from Scavenging of Hydroxyl Radicals[J].Journal of Food Science,2013,78(2):C152-C159.

[10]VALKO M,LEIBFR ITZ D,MONCOL J,et al.Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease[J].The International Journal of Biochemistry&Cell Biology,2007,39(1):44-84.

[11]ROCHETTE L,ZELLER M,COTTIN Y,et al.Diabetes,oxidative stress and therapeutic strategies[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-General Subjects,2014,1840(9):2709-2729.

[12]AHN C,KIM J,JE J.Purification and antioxidant properties of octapeptide from salmon byproduct protein hydrolysate by gastrointestinal digestion[J].Food Chemistry,2014,147:78-83.

[13]LIZ,JIANG A,YUE T,et al.Purification and identification of five novel antioxidant peptides from goat m ilk casein hydrolysates[J].Journal of Dairy Science,2013,96(7):4242-4251.

[14]ATHIRA S,MANN B,SHARMA R,et al.Ameliorative potential of whey protein hydrolysate against paracetamol-induced oxidative stress[J].Journal of Dairy Science,2013,96(3):1431-1437.

[15]ZHANG Q,LING Y,SUN Z,et al.Protective effect of whey protein hydrolysates against hydrogen peroxide-induced oxidative stress on PC12 cells[J].Biotechnology Letters,2012,34(11):2001-2006.

[16]ZOROV D B,FILBURN C R,KLOTZ L,et al.Reactive oxygen species(ROS)-induced ROS release:a new phenomenon accompanying induction of the mitochondrial permeability transition in cardiac myocytes[J].The Journal of Experimental Medicine,2000,192(7):1001-1014.

[17]XIEN,WANG C,AO J,et al.Non-gastrointestinal-hydrolysis enhances bioavailability and antioxidant efficacy of casein as compared with its in vitro gastrointestinal digest[J].Food Research International,2013,51(1):114-122.

[18]JIN M,ZHANG L,YU H,et al.Protective effect of whey protein hydrolysates on H2O2-induced PC12 cells oxidative stress via a mitochondria-mediated pathway[J].Food Chem is try,2013,141(2):847-852.

[19]CHENG X,GAO D,SONG J,et al.Casein glycomacropeptide hydrolysate exerts cytoprotection against H2O2-induced oxidative stress in RAW 264.7 macrophages via ROS-dependent heme oxygenase-1 expression[J].The Royal Society of Chemistry,2015,5:4511-4523.