莊夏衍 王揮戈 林歆勝 李創(chuàng)偉

鼻息肉是耳鼻咽喉科常見的疾病之一,具有發(fā)病率較高（我國 2%～8%）[1，2]，復(fù)發(fā)傾向強(qiáng)（術(shù)后復(fù)發(fā)率15%～40%）的特點(diǎn)[3]。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示：鼻息肉高發(fā)病率及高復(fù)發(fā)率，直接或間接增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，并嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[4]。

大量的研究發(fā)現(xiàn)，鼻息肉是由各種免疫細(xì)胞及炎癥細(xì)胞參與的持續(xù)慢性炎癥反應(yīng)的疾病[5]。鼻息肉組織中輔助性T細(xì)胞 (heleper T cell,Th)發(fā)生極化，存在Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量增多、Th1/Th2比例失衡和Th細(xì)胞因子分泌優(yōu)勢(shì)發(fā)生改變。但究竟什么因素促使Th細(xì)胞極化？哪種亞型及細(xì)胞因子占優(yōu)勢(shì)？目前仍存有分歧，無統(tǒng)一定論。

樹突狀細(xì)胞（Dendritic cell,DC）是目前已知體內(nèi)功能最強(qiáng)、唯一能直接激活靜息T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞，在機(jī)體免疫系統(tǒng)中處于核心地位。人DCs根據(jù)其表型分為兩個(gè)亞群：髓系DCs（mDCs）和淋巴系 DCs（pDCs）[6，7]，也可以根據(jù)功能分成兩個(gè)亞群，誘導(dǎo) Th1的DCs亞群（DC1s）和誘導(dǎo) Th2的 DCs亞群（DC2s）。在過去幾十年，mDCs和pDCs被認(rèn)為分別代表 DC1s和 DC2s[8，9]。CD11C和 CD123是區(qū)分人類DC1和 DC2的主要標(biāo)志[10，11]，它們?cè)诿庖邞?yīng)答中各自起著獨(dú)特而又互補(bǔ)的作用[8，12]。研究認(rèn)為，Th細(xì)胞的分化是由DC控制的，DC亞群能夠推進(jìn)CD4和CD8的應(yīng)答，DC1與DC2分別誘導(dǎo)Th細(xì)胞分化為Th1和Th2，從而調(diào)節(jié) Th1/Th2的偏向[13]。

已有研究證實(shí)鼻息肉組織中DC明顯增多[14，15]。我們采用連續(xù)切片免疫組化方法，檢測(cè)鼻息肉中CD11c和CD123的表達(dá)情況，探討CD11c+DC(DC1)和CD123+DC(DC2)亞群在鼻息肉發(fā)病機(jī)理中的意義。

資料與方法

1 一般資料

鼻息肉組：接受鼻內(nèi)鏡手術(shù)的鼻息肉患者。共30例，男 16例，女 14例，年齡 18～66歲，平均（37±16）歲。如有以下情況即被排除出此研究：單側(cè)病變、上頜竇后鼻孔息肉、纖毛不動(dòng)綜合征、鼻竇手術(shù)史、哮喘史、阿司匹林耐受不良史及全身嚴(yán)重疾病史。術(shù)前2周內(nèi)無全身或局部使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及任何種類鼻噴劑。

下鼻甲黏膜組：接受鼻中隔矯正術(shù)的患者共30例，男 20例，女 10例，年齡 18～59歲，平均（30±12）歲。選擇標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)中正常下鼻甲組織，既往無變應(yīng)性鼻炎、慢性鼻竇炎、鼻息肉及全身嚴(yán)重疾病史。

2 試劑及儀器

鼠抗人Integrin X(CD11c)、鼠抗人IL-3R(CD123)（Santa Cruz公司產(chǎn)品）；DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；PV-6002二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）

3 實(shí)驗(yàn)方法

收取標(biāo)本后修剪成1cm×1cm×1cm大小的組織塊，用10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋切片。鼻息肉組每張切片HE常規(guī)染色。以同一標(biāo)本兩張連續(xù)切片分別采用免疫組織化學(xué)二步法檢測(cè)CD11c、CD123。

4 結(jié)果觀察和判定

在光學(xué)顯微鏡下，觀察HE染色后鼻息肉組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤情況（圖1，圖2）。

圖1 鼻息肉組織HE染色（標(biāo)尺：100μm）

圖2 鼻息肉組織HE染色（標(biāo)尺：100μm）

選擇乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)標(biāo)本作為陽性對(duì)照，以PBS替代一抗作陰性對(duì)照。以背景清晰、胞漿染成淡黃色、棕黃色為陽性細(xì)胞。每張切片在低倍鏡下隨機(jī)選取DC分布最密集的10個(gè)區(qū)，更換至高倍鏡(HPF×400)，計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野內(nèi)DC的總數(shù)代表該標(biāo)本切片DC的浸潤程度。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。CD11c、CD123分別在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中表達(dá)的陽性率比較采用四格表卡方檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)后，實(shí)驗(yàn)組CD11c+DC與CD123+DC的比較采用配對(duì)卡方檢驗(yàn)和配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 HE染色光鏡觀察結(jié)果

以淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤為主的標(biāo)本達(dá)70%，以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤為主的標(biāo)本僅占30%。

2 CD11c的表達(dá)情況

CD11c+DC胞膜有明顯微狀突起，胞體較大，胞漿呈淡黃色或棕黃色，核多偏位，在鼻息肉組織上皮下基底部和腺體周圍分布較多，間質(zhì)中有少量散在分布（圖3）。在對(duì)照組中，僅有極少量CD11c+DC在上皮下基底部和腺體周圍分布（圖4），63.3%的標(biāo)本甚至沒有陽性細(xì)胞出現(xiàn)。

圖3 CD11C+DC在鼻息肉組織中的分布（標(biāo)尺：50μm）

圖4 CD11C+DC在正常下鼻甲黏膜中的分布（標(biāo)尺：50μm）

CD11c在鼻息肉組的表達(dá)與對(duì)照組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（a＝0.05，P＜0.01）（表 1）。

表1 CD11c在鼻息肉組織和正常下鼻甲黏膜中的表達(dá)情況的比較

圖5 CD123+DC在鼻息肉組織中的分布（標(biāo)尺：50μm）

CD123在鼻息肉組的表達(dá)與對(duì)照組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)意義（a＝0.05，P＜0.01）（表 2）。

表2 CD123在鼻息肉組織和正常下鼻甲黏膜中的表達(dá)情況

3 CD123的表達(dá)情況

CD123陽性細(xì)胞均具有DC2特殊細(xì)胞形態(tài)，呈卵圓形，體積較CD11c陽性細(xì)胞小，胞質(zhì)呈棕黃色，核略偏位，在鼻息肉組織上皮下基底部和腺體周圍分布較多，間質(zhì)中有少量散在分布（圖5），而在對(duì)照組中，僅有極少量分布在血管和腺體周圍，有的甚至幾乎沒有表達(dá)（圖6）。

圖6 CD123+DC在下鼻甲黏膜中的分布（標(biāo)尺：50μm）

4 CD11c與CD123鼻息肉組織中表達(dá)情況的比較

在鼻息肉組織中，CD11c與CD123的陽性表達(dá)情況相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表3）。高倍視野下，計(jì)數(shù)鼻息肉組CD11c+DC的平均數(shù)目為109.57/10HPF，CD123+DC計(jì)數(shù)平均為 89.74/10HPF。鼻息肉組織中CD11c+DC的細(xì)胞數(shù)明顯高于CD123+DC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表 4）。

表3 鼻息肉中CD11c與CD123表達(dá)情況的比較

表4 鼻息肉組織中CD11c+DC與CD123+DC分布情況的比較

討論

近年來，有研究發(fā)現(xiàn)我國鼻息肉的組織病理學(xué)特征與全球其他地區(qū)存在著顯著差異，國內(nèi)不同地區(qū)鼻息肉的免疫病理特征也存在差異。如北京和成都就有所不同，北京鼻息肉患者呈現(xiàn)Th2/Th1/Th17混合免疫模式，而成都的鼻息肉患者以Th2免疫反應(yīng)為主的比例則非常低。Wang等[16]發(fā)現(xiàn)我國鼻息肉組織中以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤為主的僅占30%。Lou等[17]發(fā)現(xiàn)我國鼻息肉組織以淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤為主。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，潮汕地區(qū)鼻息肉以淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤為主，約占70%，與上述看法基本一致。這說明不同人種及不同地區(qū)間鼻息肉確實(shí)存在組織病理學(xué)上的差異，需要我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)這種差異的內(nèi)在機(jī)制。

Th細(xì)胞是免疫應(yīng)答中的核心淋巴細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體受抗原刺激時(shí)，Th0細(xì)胞在DC細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的協(xié)助下激活，向Thl細(xì)胞或Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化并分泌多種細(xì)胞因子。Th1細(xì)胞主要參與細(xì)胞免疫應(yīng)答；Th2細(xì)胞主要促進(jìn)體液免疫應(yīng)答，其分泌的細(xì)胞因子可促使嗜酸性粒細(xì)胞的集聚和活化。Thl細(xì)胞和Th2細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在鼻息肉發(fā)病機(jī)理中的作用日益受到重視。大量的研究發(fā)現(xiàn)[18-21]，鼻息肉組織中Th細(xì)胞發(fā)生極化，鼻息肉組織中Th1、Th2細(xì)胞均顯著高于正常鼻黏膜，并存在Th1/Th2比例失衡，Th1細(xì)胞百分率明顯高于Th2細(xì)胞，但是Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)具有普遍優(yōu)勢(shì)。炎性細(xì)胞和細(xì)胞因子相互作用，發(fā)揮網(wǎng)絡(luò)抗炎效應(yīng)，使鼻黏膜的免疫反應(yīng)性呈活化和擴(kuò)大狀態(tài)，但由于局部炎癥反應(yīng)持續(xù)存在，致使炎性細(xì)胞在發(fā)揮局部保護(hù)作用的同時(shí)又造成組織的損傷，加重局部的炎癥反應(yīng)，最終形成了鼻息肉。這提示我們，病因的多元性導(dǎo)致了免疫反應(yīng)的復(fù)雜性，鼻息肉是一類由體液免疫和細(xì)胞免疫共同參與的多種免疫機(jī)制異常的疾病。但究竟什么因素促使Th細(xì)胞極化？什么決定了哪種亞型及細(xì)胞因子占優(yōu)勢(shì)？目前無統(tǒng)一定論。

樹突狀細(xì)胞（DC）是目前已知體內(nèi)功能最強(qiáng)的、唯一能激活初始型T細(xì)胞的專職抗原提呈細(xì)胞，是機(jī)體免疫應(yīng)答的始動(dòng)者[22，23]，是機(jī)體免疫系統(tǒng)中一類不可缺少的免疫細(xì)胞。DC能調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)抗原產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答類型：細(xì)胞免疫或T細(xì)胞依賴的體液免疫（Th1/Th2型免疫反應(yīng)）。Rissoan等[8]認(rèn)為，DC亞群才是決定Th細(xì)胞向Th1細(xì)胞或Th2細(xì)胞分化的主要驅(qū)動(dòng)力。DC1/DC2比值的變化直接影響Th1/Th2細(xì)胞的分化，DC1/DC2能通過細(xì)胞因子精細(xì)地調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞的應(yīng)答平衡，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。同時(shí)，DC亞群在誘導(dǎo)Th分化時(shí)存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，Th1/Th2細(xì)胞分別通過其分泌的細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4作用于DC1/DC2，調(diào)控DC1/DC2的發(fā)育及比例，從而更精確地調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞免疫功能的動(dòng)態(tài)平衡，使機(jī)體免疫處于穩(wěn)態(tài)。

我們既往的研究發(fā)現(xiàn)，在鼻息肉組織中DC可通過一系列的細(xì)胞和體液免疫機(jī)制導(dǎo)致Th1/Th2細(xì)胞比例失衡[15]。因此，我們認(rèn)為鼻息肉組織中Th1/Th2比例失衡只是一個(gè)現(xiàn)象，DC及其亞群才很可能是Th1/Th2失衡而致免疫應(yīng)答紊亂的動(dòng)因，檢測(cè)患者鼻息肉組織中DC亞群DC1和DC2有助于我們了解鼻息肉的初始免疫狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，CD11c和CD123在鼻息肉組的表達(dá)均高于對(duì)照組，在鼻息肉組，CD11c和CD123的表達(dá)無明顯差異，但CD11c+DC與CD123+DC細(xì)胞數(shù)量的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示鼻息肉組織中存在DC1/DC2混合模式，DC1和DC2通過分別誘導(dǎo)Th1型與Th2型免疫應(yīng)答，Th1/Th2型免疫應(yīng)答并存，DC1/DC2比例失衡導(dǎo)致鼻息肉組織Th1/Th2細(xì)胞比例失衡。DC1在鼻息肉組織中占優(yōu)勢(shì)主導(dǎo)地位，在DC1的主導(dǎo)作用下Thl亞群介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)占優(yōu)勢(shì)地位。本研究發(fā)現(xiàn)鼻息肉炎癥反應(yīng)的終極結(jié)果，其組織病理學(xué)上以淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤為主(約占70%)，也從因果關(guān)系上印證了DC1在鼻息肉中占優(yōu)勢(shì)主導(dǎo)地位這一結(jié)論。這個(gè)新的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步拓展和延伸了以往單純關(guān)注細(xì)胞因子調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡的視野，將鼻息肉發(fā)病機(jī)制的研究焦點(diǎn)從對(duì)Th細(xì)胞極化的研究上升到對(duì)DC1/DC2的產(chǎn)生、發(fā)育及調(diào)節(jié)的節(jié)點(diǎn)上來，把貫穿于鼻息肉發(fā)病過程的炎癥反應(yīng)追溯到了更上游的初級(jí)始動(dòng)階段。簡而言之，就是鼻息肉研究的Th1/Th2階段進(jìn)入了DC1/DC2階段。

展望未來，通過DC亞群對(duì)Th1/Th2免疫應(yīng)答平衡這一關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)如何進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)的深入研究，必將豐富和深化對(duì)鼻息肉發(fā)病機(jī)制，尤其是對(duì)DC始動(dòng)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)路線圖的認(rèn)識(shí)，為鼻息肉的防治提供了新的思路和更精準(zhǔn)的干預(yù)靶點(diǎn)。

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