曲靈美 徐光達(dá) 李昕 于洋 印明娜 金宏林 呼曉 孫亞男

HOX基因(homeotic genes)在不同的染色體上成簇排列又稱HOX基因簇，是同源盒基因（homeobox gene）家族中的一員，是一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通過其同源域識(shí)別并結(jié)合特異的DNA序列，在機(jī)體細(xì)胞的增殖、分化等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用，進(jìn)而在某種程度上決定了胚胎的發(fā)育和后期機(jī)體器官的發(fā)育。由于HOX基因的調(diào)控作用，研究人員對(duì)其與人類腫瘤之間的相關(guān)性進(jìn)行了深入研究。實(shí)驗(yàn)表明，HOX基因的變異與發(fā)育畸形密切相關(guān)，同時(shí)還與一些腫瘤，如白血病、乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、結(jié)直腸癌等的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系[1-5]。隨著對(duì)HOX基因研究的不斷深入，HOX基因可能成為癌癥早期診斷和基因治療新的分子靶標(biāo)點(diǎn)。我們應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究HOX基因簇在喉癌中的表達(dá)譜，進(jìn)而篩選出與喉癌發(fā)生，發(fā)展密切相關(guān)的LncRNA與mRNA，為喉癌基因治療提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。

資料與方法

1 一般資料

選取哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科2014年1月～2014年5月手術(shù)切除的5例喉鱗癌組織標(biāo)本及癌旁正常組織為實(shí)驗(yàn)樣本。所有病例均為經(jīng)病理確診的初發(fā)喉鱗癌患者，并且全身檢查均未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處腫瘤轉(zhuǎn)移，術(shù)前都未施行放療、化療或其它方法治療。本試驗(yàn)所有選取的實(shí)驗(yàn)組喉鱗癌組織標(biāo)本及癌旁正常組織樣本的收集均征得患者同意，患者本人簽署知情同意書。選擇美國 Arraystar公司提供的 8×60K Human LncRNA Microarray 2.0版芯片，此芯片收錄了目前最全的LncRNA與蛋白編碼基因(mRNA)，雜交實(shí)驗(yàn)可以同時(shí)檢測LncRNA和mRNA的表達(dá)水平。

2 總RNA的抽提與質(zhì)檢

按著Trizol試劑盒分別提取5例喉癌組織及癌旁正常組織中的RNA，使用NanoDropND-1000型紫外分光光度計(jì)測定組織總RNA純度，并做進(jìn)一步的RNA完整性檢測：瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢。

3 cRNA合成，標(biāo)記，與雜交反應(yīng)

利用Agilent公司提供的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及單色標(biāo)記試劑盒，合成標(biāo)記cRNA，通過使用紫外分光光度計(jì)檢測熒光標(biāo)記率，后利用Agilent公司提供的雜交系統(tǒng)進(jìn)行雜交反應(yīng)。

4 芯片掃描及數(shù)據(jù)分析

采用Agilent Scanner G2505C掃描儀進(jìn)行掃描芯片，單色掃描后將圖像導(dǎo)入圖像分析軟件（安捷倫特征提取軟件），經(jīng)過排列，提取得到基因表達(dá)的熒光信號(hào)強(qiáng)度值，應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理分析。獲得標(biāo)準(zhǔn)化的芯片表達(dá)數(shù)據(jù)，再把數(shù)據(jù)輸入到Agilent GeneSpring GX軟件（version 1.5.1）進(jìn)行分析，圖像定量和標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)處理最后以表格的形式展示mRNA和LncRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，按Fold Change 2.0,P-value 0.05值篩選，篩選出差異表達(dá)的mRNA和LncRNA重新制作成差異表達(dá)的mRNA和LncRNA數(shù)據(jù)。

結(jié)果

經(jīng)過計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)分析，我們獲得到LncRNA和mRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)，在喉癌組織中有表達(dá)的HOX基因簇的LncRNA為278條，mRNA為178條，按著差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)：Foldchange 2.0 P-value 0.05篩選得到兩組之間差異表達(dá)的LncRNA和mRNA。篩選出差異表達(dá)的HOX基因簇的LncRNA有18條，表達(dá) 上 調(diào) 的 有 8 條 ：HOXA4-66、HOXA10-82、HOXA11-86、HOXA13-100、HOXB9-206、HOXB9-205、HOXD12-3、HOTAIR。10 倍以上變化的有 2條：HOXA11-86、HOXB9-206。4倍以上變化的有1條：HOXD12-3。2倍以上變化的有5條：HOXA4-66 HOXA10-82、HOXA13-100、HOXB9-205、HOTAIR。表達(dá)下調(diào)的有 10 條：HOXA11-92、HOXA13-97、HOXB4-171、HOXB4-173、HOXB9-187、HOXC5-254、HOXC9-131、HOXC11-114、HOXD1-49、HOXD9-16，其中4倍以上變化的有1條：HOXC5-254，2 倍以上變化的有 9 條：HOXA11-92、HOXA13-97、HOXB4-171、HOXB4-173、HOXB9-187、HOXC9-131、HOXC11-114、HOXD1-49、HOXD9-16。上調(diào)倍數(shù)最大的LncRNA：HOXA11-86(Foldchange：17.75)，下調(diào)倍數(shù)最大的LncRNA：HOXC5-254(Foldchange：7.65)。同時(shí)檢測到差異表達(dá)HOX基因簇的mRNA有17條，表達(dá)上調(diào)的有15條，10倍以上變化的有3條，4倍以上變化的有5條，2倍以上變化的有7條。表達(dá)下調(diào)的有2條，其中4倍以上變化的有1條，2倍以上變化的有1條。上調(diào)倍數(shù)最大的 mRNA：NM_000523(Foldchange：21.47)，下調(diào)倍數(shù)最大的 mRNA：NM_018952(Foldchange：4.59)，（見表 1-表 4）。

表1 喉癌組織與癌旁正常組織相比，10倍以上表達(dá)上調(diào)的HOX基因簇LncRNA

表2 喉癌組織與癌旁正常組織相比，下調(diào)倍數(shù)最大的的HOX基因簇LncRNA

表3 喉癌組織與癌旁正常組織相比，10倍以上表達(dá)上調(diào)的HOX基因簇mRNA

表4 喉癌組織與癌旁正常組織相比，下調(diào)倍數(shù)最大的的HOX基因簇mRNA

討論

我們研究發(fā)現(xiàn)，同一條基因HOXB9轉(zhuǎn)錄的不同LncRNA表達(dá)上調(diào)變化倍數(shù)不同：HOXB9-206表達(dá)上調(diào)12.8倍，HOXB9-205表達(dá)上調(diào)2.9倍。同一條基因轉(zhuǎn)錄的不同LncRNA表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的情況也有所不同：HOXA11-86表達(dá)上調(diào)，HOXA11-92表達(dá)下調(diào)；HOXA13-100表達(dá)上調(diào)，HOXA13-97表達(dá)下調(diào)；HOXB9-206表達(dá)上調(diào)，HOXB9-187表達(dá)下調(diào)。這種看似矛盾的功能恰恰表明了HOX基因簇的功能復(fù)雜性。

這些LncRNA在喉癌組織中差異表達(dá)，提示它們可能參與了喉癌的發(fā)病過程，但LncRNA通過何種機(jī)制來影響喉癌的發(fā)生發(fā)展，目前尚不明確。這些上調(diào)表達(dá)的LncRNA可能通過某種途徑作用于原癌基因，使其激活促進(jìn)腫瘤發(fā)生，同理，下調(diào)表達(dá)的基因也可能通過某種途徑作用于抑癌基因，使其滅活促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多因素、和多基因改變的過程,其中細(xì)胞增殖失控、細(xì)胞周期調(diào)控失常和較強(qiáng)的侵襲性被認(rèn)為是癌癥發(fā)生和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制。有研究報(bào)道，某些LncRNAs調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞存活的作用可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生及/或發(fā)展。某些LncRNAs則具有抑制細(xì)胞過度生長、繁殖從而遏制腫瘤形成的作用。在癌癥中通過表觀遺傳機(jī)制，許多抑癌基因常被LncRNA沉默。查閱文獻(xiàn)，目前尚未發(fā)現(xiàn)除HOTAIR外的上述LncRNA與喉癌有相關(guān)性報(bào)道，說明HOX基因簇的LncRNA研究是一個(gè)嶄新的領(lǐng)域，可能發(fā)現(xiàn)喉癌的新的信號(hào)傳導(dǎo)通路，在“喉癌/喉癌旁組織”相互比對(duì)的芯片研究中得到的這些差異表達(dá)的LncRNA是否對(duì)喉癌的發(fā)生、分化乃至于整個(gè)喉癌具有相關(guān)意義？為解決這一問題，下一步我們要繼續(xù)擴(kuò)大疾病樣本量，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)來驗(yàn)證上述基因芯片的結(jié)果。

通過基因數(shù)據(jù)庫得到差異表達(dá)的17條HOX基因簇 mRNA對(duì)應(yīng)的基因?yàn)椋篐OXA5，HOXA7，HOXA9，HOXA10，HOXB6，HOXB7，HOXB9，HOXB13,HOXC4，HOXC5，HOXC6，HOXC8，HOXC10，HOXC11,HOXD1，HOXD4，HOXD13。查閱文獻(xiàn)，目前尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于這些基因與人類喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的相關(guān)報(bào)道，說明HOX基因簇的mRNA研究是一個(gè)嶄新的領(lǐng)域，可能發(fā)現(xiàn)喉癌的新的信號(hào)傳導(dǎo)通路。

綜上所述，喉癌組織中這些差異表達(dá)的LncRNA與mRNA，可能通過不同的機(jī)制在喉癌的發(fā)病中起重要作用，但是具體機(jī)制目前還不明確。在這些差異表達(dá)的LncRNA與mRNA中，哪些發(fā)揮核心作用？它們的確切作用機(jī)制是什么？這些問題都需要在下一步實(shí)驗(yàn)以及今后的研究工作中去探索。

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