林貝 李健秀 劉雪凌

（燕京理工學院，廊坊 065201）

隨著環(huán)境污染的日益加劇和化石能源的日益枯竭，可再生清潔能源生物乙醇的開發(fā)和利用受到了廣泛關(guān)注。木質(zhì)纖維素是世界上最豐富的生物物質(zhì)資源，利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇具有重大的經(jīng)濟價值和社會意義［1］。預處理是利用木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)的首要環(huán)節(jié)，迄今為止國內(nèi)外研究開發(fā)了包括物理法、化學法、生物法等在內(nèi)的多種預處理技術(shù)［2］。在預處理過程中會產(chǎn)生一些毒副產(chǎn)物（抑制劑），影響到微生物的正常生長和隨后的發(fā)酵過程［3］。雖然預處理的方法不同，產(chǎn)生的抑制劑種類和含量也有一些變化，但是主要為呋喃醛類化合物、酚類化合物和弱酸3大類［4］。以下綜述了各類抑制劑的形成及其作用機制，并討論了對于抑制劑的應(yīng)對措施，旨為該領(lǐng)域研究人員提供方法的參考。

1 抑制劑的形成及其作用機制

1.1 呋喃醛類化合物

呋喃醛類化合物主要包括糠醛和羥甲基糠醛（HMF），分別由戊糖和己糖脫水形成［4-5］，其中，糠醛的毒性大于HMF，兩者具有相似的抑制作用和作用機制，抑制菌體生長，使延滯期增長，降低乙醇得率和產(chǎn)量，其中對菌體生長的抑制作用要強于對乙醇生成的抑制作用［6］。本文作者通過實驗證實，糠醛在0.5-1.5 g/L范圍內(nèi)對菌體生長有抑制作用，但使乙醇得率提高［7］。此外，糠醛和HMF對微生物的抑制還存在著協(xié)同效應(yīng)，兩者共同存在時對微生物發(fā)酵的抑制效果更加明顯［8］。

呋喃醛類化合物可能的抑制機制有：（1）以糠醛和HMF為代表的呋喃醛類化合物會直接抑制微生物代謝過程中一些關(guān)鍵酶（如乙醇脫氫酶、丙酮酸脫氫酶和醛脫氫酶等）的生物學活性［9-10］，從而影響微生物對糖的代謝及乙醇的生成過程。（2）兩者都可被酵母的醛還原酶轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的毒性較低的醇，轉(zhuǎn)化過程需要消耗ATP和NAD（P）H?？啡┑霓D(zhuǎn)化需要輔酶NADH，NADH的減少以及糠醛對乙醇脫氫酶的直接抑制造成了乙醛在胞內(nèi)積累，從而使菌體生長受到抑制，乙醇生成延遲［6］。HMF的轉(zhuǎn)化偏好NADPH，而氨基酸與核酸的合成需要NADPH，HMF的轉(zhuǎn)化與生物物質(zhì)的合成和細胞生長相競爭。因此，糠醛和HMF存在，會與微生物代謝過程中的酶爭奪NAD（P）H，使得代謝活動被抑制或延遲。（3）糠醛和HMF會降解DNA，阻礙mRNA的翻譯和蛋白質(zhì)合成的過程，Iwaki［11］等研究證實糠醛和HMF會誘導信使RNP顆粒的形成和衰減釀酒酵母內(nèi)的翻譯活動，使得酵母細胞生理狀態(tài)退化。（4）近些年來的研究證實糠醛還會誘導釀酒酵母中活性氧（ROS）的積累，引起細胞損傷，細胞暴露在高濃度糠醛下，會導致細胞膜破壞，核染色質(zhì)和肌動蛋白破壞，甚至死亡［12］。Allen等［12］通過實驗發(fā)現(xiàn)當酵母在糠醛濃度25 mmol/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，經(jīng)過一段延滯期之后可恢復生長，而當糠醛濃度50 mmol/L時則嚴重抑制了菌體的生長。在一定濃度范圍內(nèi)，酵母可通過將抑制因子轉(zhuǎn)化為低毒的醇而具有一定的耐受性，轉(zhuǎn)化即在生長延滯期進行，這時乙醇的產(chǎn)生以及相應(yīng)的酶都被抑制，當抑制因子減少，生長便會重新開始，前提是細胞必須能夠在毒性作用下幸存并修復產(chǎn)生的損傷。與50 mmol/L糠醛相比，25 mmol/L糠醛引起的細胞損傷減少，因此酵母在延滯期后能恢復生長。

1.2 弱酸

木質(zhì)纖維素水解液中的弱酸包括乙酸、甲酸和乙酰丙酸。乙酸是由兩種方式形成的：在預處理的過程中，半纖維素在高溫水解等作用下脫乙?；桑?］；發(fā)酵過程中形成的副產(chǎn)物。甲酸由糠醛和HMF分解形成；乙酰丙酸由HMF分解形成［4-5］。

弱酸造成了胞內(nèi)環(huán)境的酸化，必須通過消耗ATP 將多余的質(zhì)子泵出以維持胞內(nèi)的中性環(huán)境，影響了細胞正常的能量供給［13］。在一定濃度范圍內(nèi)，弱酸對乙醇生成有促進作用，所消耗的糖更多的轉(zhuǎn)化為乙醇，而在高于這一濃度時，乙醇得率則會降低［14-15］。這一現(xiàn)象可能是由于在弱酸存在下，需要額外的ATP產(chǎn)生，于是以減少生物量的生成為代價，強迫細胞通過代謝糖生成酒精來產(chǎn)生ATP。酒精生成受兩方面的影響，生物量及ATP高需求的影響，弱酸濃度較低時，以ATP高需求因素為主，因此對酒精生成有促進作用，所消耗的糖更多的轉(zhuǎn)化為酒精，而菌體生長受到一定的抑制，胞內(nèi)陰離子的積聚及與酸的直接接觸也都有可能影響到菌的生長，當弱酸濃度增高時，則導致細胞膜破壞，細胞活性下降甚至死亡［16］。作者通過研究甲酸、乙酸對酵母發(fā)酵的影響，證實甲酸和乙酸對菌體生長的抑制強于對乙醇生成的抑制，且甲酸的抑制程度遠大于乙酸［7］。此外，有研究表明，當pH5-6的發(fā)酵液中乙酸濃度達到7.5 g/L（125 mmol/L），菌體生長就被明顯抑制，且發(fā)酵環(huán)境的pH值對甲酸和乙酸的抑制作用有重要影響，較高的pH環(huán)境有利于減弱其抑制作用［17］。

1.3 酚類化合物

酚類化合物主要由木質(zhì)素在高溫酸解等預處理過程中分解產(chǎn)生［2，4-5］，可分為3大類：以4-羥基苯甲醛等為代表的p-羥苯基化合物；以丁香醛等為代表的丁香族化合物；以愈創(chuàng)木酚、香草醛等為代表的愈創(chuàng)木酚族化合物［18］。關(guān)于酚類化合物的研究相對較少，其抑制機理到目前還不是很清楚，通常認為其毒性較大，可以造成細胞膜部分或整體的破壞，從而影響細胞生長和糖的利用［4］。另有研究表明，高濃度的香草醛會抑制翻譯過程，影響蛋白質(zhì)的合成［18］。

Yi等［19］分別選取4-羥基苯甲醛、丁香醛、香草醛作為p-羥苯基化合物、丁香族化合物、愈創(chuàng)木酚族化合物的代表，研究3種化合物對Zymomonas mobilisZM4生長及發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響，結(jié)果表明，在分別添加5 mmol/L的4-羥基苯甲醛、丁香醛、香草醛的情況下，最大細胞密度依次降低了5倍、1.4倍和3.1倍，葡萄糖消耗和酒精生成分別延遲了12、16、24 h，酒精體積生產(chǎn)率由0.73分別降至0.24、0.70和0.61 g/L/h。以上3種化合物中，分子量最低的4-羥基苯甲醛的毒性最大；并體現(xiàn)了取代基位置對抑制作用的影響；實驗中還發(fā)現(xiàn)3種化合物都可以被Zymomonas mobilisZM4降解為相應(yīng)的醇。這些結(jié)論與先前對于酵母的研究具有類似性［4］，可為酚類化合物抑制機理的深入研究提供依據(jù)。

這些抑制劑的存在對乙醇發(fā)酵的影響，已成為木質(zhì)纖維素乙醇生物加工過程的主要瓶頸之一。為減少抑制劑影響，可采取以下幾種策略：（1）防止在預處理中形成抑制劑；（2）發(fā)酵前進行脫毒；（3）篩選耐受性微生物或?qū)ξ⑸镞M行耐受性改造等。

2 預處理方式及脫毒措施減少抑制劑濃度

近些年來，圍繞著減少抑制劑的產(chǎn)生，發(fā)展了多種預處理方法。研究發(fā)現(xiàn)，溫和的熱水預處理（未添加酸催化劑）［20］、瞬間彈射蒸汽爆破（ICSE）技術(shù)［21］、60Coγ輻照的方法［22］，均在不同程度上降低了某些抑制劑的濃度。此外，研究人員通過在預處理過程中加入催化劑，或?qū)蓚€或多個預處理技術(shù)結(jié)合使用有效減少了抑制劑的產(chǎn)生。Jacquet等［23］在水稻、甘蔗渣和芒草的蒸汽預處理過程中使用二氧化碳或二氧化硫等催化劑，有效降低了抑制劑的濃度。Zhu等［24］研究了用微波與NaOH和H2SO4協(xié)同處理芒草，與單一的預處理方法相比，不但使抑制劑濃度降低，還使糖的濃度升高，大大縮短了預處理的時間。

采用不同的預處理工藝可在源頭上控制抑制劑的產(chǎn)生。但是，選用預處理方法時不僅要考慮產(chǎn)生的抑制劑濃度，更重要的是要綜合考慮高纖維素和隨后的高糖產(chǎn)量等預處理效果，以及技術(shù)、經(jīng)濟等因素，以滿足工業(yè)需求。因此，實際選取的最適預處理方法有時無法滿足低抑制劑濃度的要求。在積極探索降低抑制劑濃度的預處理方法的同時，發(fā)展合適的脫毒方法，是減少發(fā)酵抑制物的又一有效措施。

近幾十年來，人們嘗試了多種方法對木質(zhì)纖維素水解液進行發(fā)酵前的脫毒處理，包括生物方法、物理方法、化學方法以及多種方法聯(lián)用，脫毒方法各有優(yōu)缺點，且不同的方法對各種不同抑制物的去除效果也有較大差異［25-26］。利用微生物脫毒的效果顯著，Cao等［27］使用C. ligniariaNRRL30616 對玉米秸稈水解液進行脫毒處理，去除了＞95%的乙酸和＞50%的糠醛、HMF以及酚類化合物。煤油霉菌Amorphotheca resinaeZN1［28］是目前比較理想的用于脫毒的微生物，能夠快速降解乙酸、糠醛、HMF，且脫毒過程不使用任何耗水和耗能的操作［29］，具有工業(yè)實用價值。脫毒雖然是減少抑制物的有效的方法，但是多數(shù)脫毒過程會造成糖的損失和生產(chǎn)成本的增加。目前，隨著大量的微生物被發(fā)現(xiàn)具有“脫毒”的功能，人們將研究的重點放在了菌株上，選育那些能夠?qū)σ种莆镌幻摱镜母吣褪苄跃辏瑢ι镔|(zhì)乙醇轉(zhuǎn)化工業(yè)的發(fā)展有著很重要的實際應(yīng)用價值。

3 耐受抑制劑的菌株的選育

近些年來，針對耐受性微生物，尤其是對酵母菌在抑制劑存在下的響應(yīng)及分子水平上的適應(yīng)性進行了大量研究，已經(jīng)獲得了酵母細胞對抑制物響應(yīng)的許多基礎(chǔ)信息［30］，這些為耐受性菌株的改造提供了依據(jù)。目前，人們已通過篩選、誘變、馴化、代謝工程改造等方法以及這些方法的聯(lián)合應(yīng)用，獲得了一些較為理想的用于木質(zhì)纖維素乙醇轉(zhuǎn)化的菌種。

3.1 通過篩選、誘變獲得耐性菌株

從自然界中直接分離耐抑制劑菌株是一種經(jīng)濟實用的方法。在自然界的長期進化過程中，有些菌株體現(xiàn)出了在耐抑制劑能力方面的特性和穩(wěn)定性。通過研究發(fā)現(xiàn)，S. cerevisiaeATCC 4124、S.cerevisiaeTMB3000、S. cerevisiaeKF-7等均表現(xiàn)出了較強的抑制物耐受性［31-32，15］。Mattam 等［33］從土壤中篩選出菌株Candida tropicalisMTCC 25057，不但有較強的抑制物耐受性，還具有在32-42℃產(chǎn)纖維素酶和木聚糖酶的能力，可用于糖化-發(fā)酵聯(lián)合生物工藝（CBP）［34-35］中。此外，用木質(zhì)纖維素水解液或是混合抑制物模擬水解液從自然界尤其是富含木質(zhì)纖維素原料的地點有目的的進行篩選是一種更加快速、有效的方式［36］。

誘變篩選是微生物菌種改良常用的技術(shù)，一般可采取紫外線（UV）、X射線等物理誘變方法或利用烷化劑甲基磺酸乙酯（EMS）等化學誘變方法。研究表明，通過紫外線誘變得到的突變株，對抑制物的耐受性提高，發(fā)酵性能提高［37-39］。Srisuda等［40］對Scheffersomyces shehatae進行紫外照射，采用TTC方法初篩后，依次用杜漢發(fā)酵管、限氧條件培養(yǎng)篩選出突變株TTC79，對抑制劑的耐受性提高，且與野生菌株相比，木糖代謝增多，乙醇的生成增多，在對甘蔗渣水解液的發(fā)酵中，乙醇的得率、體積生產(chǎn)率及理論收率分別為0.46 g/g、0.20 g/L/h和90.61%，高于野生型的對應(yīng)值0.20 g/g、0.04 g/L/h和39.20%。此外，研究證明誘變往往會帶來菌株多種性能的提高或改變，不僅會提高其對抑制物的耐受性，而且有很大的概率會提高其對高糖、酒精以及高溫的耐受性能。Kumari等［41］通過甲基磺酸乙酯、n-甲基-n-硝基-n-亞硝基胍、近和遠紫外線照射依次連續(xù)對葡萄糖-木糖共發(fā)酵的混合酵母菌RPR39進行誘變，獲得的突變體RPRT90不但對糠醛、乙酸等抑制劑的耐受性提高，對乙醇、高溫等脅迫的耐受性也顯著提高，發(fā)酵生成的乙醇量相對原始菌株明顯提高?？梢姡T變是改造菌種的有效方式，可通過不斷的摸索嘗試，開發(fā)新方法，得到優(yōu)良的耐受抑制劑的菌株。

自然篩選和誘變篩選具有一定的隨機性，但是方法簡單易行，得到的這些菌株除了可以直接用于發(fā)酵外，也可作為菌種馴化或代謝工程技術(shù)改造的出發(fā)菌株。

3.2 通過進化工程馴化提高菌株的耐受性

進化工程馴化是讓細胞長期處于某一環(huán)境中，提高菌株對環(huán)境的適應(yīng)力。在抑制劑存在的條件下，不斷進行細胞傳代篩選可逐漸富集并得到對抑制劑耐受性增強的菌株。目前，馴化手段已經(jīng)成功的用于提高酵母對抑制物環(huán)境的耐受性。最初的研究集中在提高菌株對某種抑制劑的耐受性，近年來更多使用復合抑制劑環(huán)境或水解液環(huán)境對菌株進行長期馴化，使其能夠在多種抑制物存在下生長和發(fā)酵產(chǎn)乙醇。Pereira等［42］在連續(xù)反應(yīng)器中流加未脫毒的硬木亞硫酸鹽水解液，使其濃度逐漸升高20%-60%（V/V）馴化Scheffersomyces stipitis，經(jīng)過382代后，在含有60%未脫毒水解液的固體培養(yǎng)基上篩選出最先生長的10個菌株，為了保證它們的穩(wěn)定性，用非選擇性平板培養(yǎng)基連續(xù)轉(zhuǎn)接十次，之后在含有60%未脫毒水解液的液體培養(yǎng)基中測試其發(fā)酵性能，從中篩選出優(yōu)勢菌株。Koppram等［43］用在12種抑制劑存在的情況下在搖瓶中進行重復批次培養(yǎng)，以及在云杉水解液中進行恒化培養(yǎng)兩種方式馴化經(jīng)過紫外誘變處理后的重組木糖代謝菌株Saccharomyces cerevisiaeTMB3400，分別馴化了429代和97代，得到相應(yīng)的菌株RK60-5、RKU90-3和KE1-17，它們在水解液中的生長及乙醇生成比原菌株均有顯著提高。值得一提的是，重復批次馴化得到的菌株（RK60-5和RKU90-3）在厭氧條件下無法代謝木糖，而在恒化器中馴化的菌株KE1-17具有與原菌株TMB3400相似的木糖代謝速率，且對糠醛和HMF的轉(zhuǎn)化速率分別增加了3.5倍和4倍?？梢娊?jīng)不同形式的馴化后，菌株的發(fā)酵性能顯示出較大的差異。初期的馴化研究主要是采用搖瓶的形式，其為進一步的馴化研究奠定了基礎(chǔ)，但是由于搖瓶發(fā)酵的氧氣、pH等條件不確定，因此，穩(wěn)定的連續(xù)培養(yǎng)馴化是更為有效的形式。

在馴化過程中，微生物通過基因水平上的隨機突變的積累不斷適應(yīng)環(huán)境的變化，其機理有待于進一步研究。Almario等［44］用玉米秸稈稀酸水解液馴化Saccharomyces cerevisiae，研究發(fā)現(xiàn)，有些馴化后的突變體反而對單個抑制劑的耐受性減弱，盡管它們對于組合抑制劑的耐受性是增強的?？梢婑Z化過程中菌株對抑制劑適應(yīng)性變化的復雜性。

近幾年來，通過實時追蹤進化過程（VERT）、利用代謝組學、轉(zhuǎn)錄組學、單基因敲除和微陣列分析等技術(shù)研究馴化后的菌株耐受抑制劑的分子機制，取得了一些研究成果，不但可用來解釋菌株的耐受機制，同時也為代謝工程改造菌株提供了依據(jù)和目標［42-46］。

3.3 通過代謝工程手段提高菌株耐受性

代謝工程作為菌體改造的手段，相比篩選、馴化等菌株改良方式，具有更加集中的定向性和針對性。目前，關(guān)于釀酒酵母對于單個抑制劑的響應(yīng)研究已經(jīng)比較成熟，在此研究的基礎(chǔ)上，通過在酵母內(nèi)超表達相應(yīng)的基因，已經(jīng)定向設(shè)計出了一些針對某種抑制劑的高耐受性菌株［47］。

近幾年來，逐步開展了耐受菌株對于多抑制劑共存時的響應(yīng)研究，Wang等［45］研究了耐受菌株對乙酸、糠醛、苯酚混合抑制物的響應(yīng)，通過代謝組學分析及單基因敲除，表明馴化后的耐受性菌株的代謝活動增強，并確定了在多抑制劑耐受中起關(guān)鍵作用的基因。Thompson等［46］通過比較轉(zhuǎn)錄組學得出了在13種抑制劑同時存在下的52種可能與脅迫相應(yīng)的基因，并通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在抑制劑的脅迫作用下，原始菌株的線粒體形態(tài)發(fā)生破壞，而馴化后的菌株基本沒有被破壞，且呈現(xiàn)了線粒體基因的高表達，作者提出，線粒體及其相關(guān)基因?qū)昕挂种苿┠芰ζ鹬匾淖饔?，且可修復抑制劑引起的損傷，是將來的重點研究方向。Pereira等［48］考查了釀酒酵母在麥秸水解液中對抑制劑的應(yīng)答，通過全基因組掃描，確定了200余種相關(guān)基因，且它們同時在維生素代謝、線粒體活動等生物學功能中起作用。這些研究成果均為代謝工程改造菌種提供了依據(jù)和作用靶標，同時，從以上研究中能夠看出通過代謝工程改造菌株使其耐受多種抑制劑的復雜性。因此，有學者認為針對抑制劑的代謝工程改造在工業(yè)上并不實用，因為抑制劑種類、濃度范圍很寬，不可能確定所有抑制劑轉(zhuǎn)化和耐受的相關(guān)基因以及它們之間復雜的關(guān)系［49］。

此外，有報道提出通過代謝工程改造釀酒酵母，使其能夠在脅迫下產(chǎn)生亞精胺，從而增強對乙酸和呋喃類化合物的耐受性［50］。由于有機酸對細胞膜組成和功能的影響，通過調(diào)控一個或多個與細胞膜生成有關(guān)的基因，可減輕其毒害作用［50］。針對高濃度抑制物對翻譯過程的抑制，Ishida等［18］用ALD7作為啟動子有效促進了ALD6的表達，研究表明以ALD7作為啟動子可克服由香草醛、糠醛、HMF引起的mRNA翻譯的抑制，同時也為培育優(yōu)良的菌種提供了一種新的基因工程方法。通過多種代謝工程手段提高菌株對抑制物的耐受性具有很大的發(fā)展?jié)摿?，是近些年來的研究熱點。

篩選、誘變、馴化、代謝工程改造等方法各有其優(yōu)勢。目前，開始聯(lián)合使用幾種方法來提高菌株的抑制劑耐受性。如進化工程馴化與基因組重排相結(jié)合，篩選、γ射線輻射誘變與馴化聯(lián)用均有效提高了Saccharomyces cerevisiae的抑制劑耐受性［49，51］。本實驗室采用紫外誘變、馴化相結(jié)合的方法對工業(yè)釀酒酵母Sc4126［52］進行改造，篩選獲得一株對復合抑制劑（2 g/L糠醛、5 g/L乙酸、1 g/L香草醛）耐受性有所提高的菌株Sc4126-1。

4 總結(jié)

利用木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇具有深遠的意義，預處理產(chǎn)生的抑制劑是限制其發(fā)展的因素之一。在木質(zhì)纖維素乙醇生物加工過程中，要針對不同的體系并綜合考慮后續(xù)的纖維素酶處理和發(fā)酵過程，探索最適的預處理方式、脫毒方法，以及菌株的改良方法等。此外，發(fā)酵過程中的控制也可以有效減少抑制物的毒害作用，如Zhu等［53］將SSCF過程應(yīng)用于高固體物料量的發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)，使用該策略可有效避免抑制劑對發(fā)酵菌株的毒害作用，郝學密等［54］在發(fā)酵過程中采用氧化還原電位（Oxidation potential，ORP）調(diào)控，提高了釀酒酵母細胞對抑制劑的耐受性。

在這些應(yīng)對措施中，對微生物進行代謝工程改造目前被認為是克服抑制劑對乙醇發(fā)酵影響的最有前途的方法［55-56］。隨著基因組學、蛋白質(zhì)組學等系統(tǒng)生物學方法的應(yīng)用，微生物耐受抑制劑的分子機制逐漸被揭示，并確定了若干與抑制劑耐受相關(guān)的基因［45-48］，利用合成生物學方法［57-58］人工設(shè)計和構(gòu)建耐受微生物是未來的研究方向。解決抑制劑對于乙醇發(fā)酵的影響這一主要技術(shù)瓶頸，木質(zhì)纖維素大規(guī)模生產(chǎn)乙醇定會取得較大進展。

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