袁林 黃朝 曾靜 郭建軍 張婷 呂珺

（江西省科學院微生物研究所，南昌 330096）

植酸酶又稱肌醇六磷酸酶，是能夠將植酸分解為肌醇和無機磷的一類磷酸酯酶，廣泛地存在于動物、植物、微生物中［1-3］。植酸酶在飼料工業(yè)具有廣闊的應用前景和巨大的商業(yè)價值。植酸酶作為飼料添加劑能夠提高磷的利用率，減輕植酸磷對環(huán)境的污染；解除飼料中植酸的抗營養(yǎng)作用，提高機體對多種微量元素及蛋白質的利用率、促進動物生長發(fā)育和提高其生產性能、減少動物糞便中磷的排放［1-3］。目前，約75%的單胃動物飼料中含有植酸酶，植酸酶的全球市場總銷售額高達3.5億美元，并以每年10%的速度增長［4］。

植酸酶作為一種單胃動物飼料添加劑，其飼喂效果已經在世界范圍內得到確認［5］。但是，目前我國植酸酶在飼料中的推廣和應用還相當有限，究其原因主要是：天然材料中植酸酶含量太低導致植酸酶生產成本過高；當前商業(yè)化植酸酶的熱穩(wěn)定性、活性、pH作用范圍以及蛋白酶抗性等酶學性質難以完全滿足飼料工業(yè)的要求［6-7］。近年來利用基因工程技術提高植酸酶的表達量，以及隨著對植酸酶晶體結構的揭示，利用基因工程技術和蛋白質工程技術在分子水平上改造植酸酶基因，從而改變植酸酶的酶學性質，提高其在飼料中使用的有效性已成為國內外學者研究的熱點［8-9］。

耶爾森氏菌屬Yersinia來源的植酸酶具有酸性條件下的高穩(wěn)定性和高酶活、較強的蛋白酶抗性和熱穩(wěn)定性等突出性質［10-15］。因此，來源于Yersinia的植酸酶在飼料工業(yè)具有巨大的應用潛力，目前德國BASF公司正在對來源于Yersinia的植酸酶進行商業(yè)化生產［5］。來源于Yersinia intermedia的植酸酶YiAPPA是目前已知的植酸酶活性最高的植酸酶，其酶活高達3 960 U/mg（37℃、pH4.5），是目前應用最廣泛的植酸酶Aspergillus nigerPhyA酶活的40倍［10］。YiAPPA屬于組氨酸酸性磷酸酶（Histidine acid phosphatase，HAP，EC 3.1.3.2）， 具 有 HAP分子結構和催化機制上的共同特征［10］。其最適反應條件為55℃、pH4.5；于pH2.0-5.5條件下具有50%以上的相對酶活；于pH1.0-8.0條件下具有80%以上的穩(wěn)定性；于80℃保溫15 min后，YiAPPA的剩余酶活約為54%；對于胃蛋白酶和胰蛋白酶均具有較強的抗性。YiAPPA的酶學性質使其在飼料工業(yè)中具有巨大的應用潛力，但是YiAPPA的酶學性質（特別是熱穩(wěn)定性）難以完全滿足飼料工業(yè)的要求。以YiAPPA的熱穩(wěn)定性為例，飼用酶在飼料的造粒過程中一般需要經過一個75-93℃的短暫高溫，而YiAPPA于80℃的半衰期僅為15 min，尚難以達到飼料工業(yè)的要求。本研究擬將YiAPPA與來源于嗜熱菌Geobacillus thermoleovorans的嗜熱酸性α-淀粉酶GTamy的生淀粉結合域SBD進行融合，獲得酶學性質改良的融合酶，從而提高植酸酶YiAPPA在飼料工業(yè)中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 大腸桿菌Escherichia coliJM109、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisWB600、枯草芽孢桿菌表達載體pSTOP1622、重組質粒pSTOP1622-AbnA-gtamyhds均由本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 大腸桿菌E. coliJM109和枯草芽孢桿菌B. subtilisWB600的培養(yǎng)均采用LB培養(yǎng)基。

1.1.3 試劑 KOD-Plus-neo DNA聚合酶購自日本Toyobo公司；DNA限制性內切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、蛋白質Marker購自美國Fermentase公司；DNA膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒E.Z.N.A.購自美國Omega Bio-tek公司；Chelating SepharoseTMFast Flow購自美國GE Healthcare公司；Bradford法蛋白濃度測定試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；其他化學試劑均為國產或進口分析純；基因合成由上海博益生物科技有限公司完成，聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）引物合成和測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 分子克隆技術和表達產物的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析 分子克隆技術和表達產物的SDS-PAGE分析參照文獻［16］進行。

1.2.2 重組質粒pSTOP1622-yiappah和pSTOP1622-yiappa-sbdh的構建及鑒定 由上海博益生物科技有限公司合成包含編碼來源于Bacillus subtilisUS417的植酸酶的信號肽［17］、不含信號肽的YiAPPA以及連接肽（G4S）2的核苷酸序列。根據人工合成的基因序列設計PCR引物P1、P2及P3，如表1所示。以合成基因為模板，以P1、P2為引物，進行PCR擴增。PCR 擴增條件為：98℃ 5 min；98℃ 20 s，60℃ 20 s，74℃ 2 min，30個循環(huán)；74℃，10 min。擴增產物經SpeI和SacI雙酶切，連接至載體pSTOP1622，構建重組質粒pSTOP1622-yiappa。以合成基因為模板，以P1、P3為引物，進行PCR擴增，PCR擴增條件同上。擴增產物經SpeI和SacI雙酶切，連接至載體pSTOP1622，構建重組質粒pSTOP1622-yiappah。采用SpeI和SacI雙酶切重組質粒鑒定是否有外源基因的插入。根據嗜熱酸性α-淀粉酶GTamy的基因序列設計PCR擴增其淀粉結合域SBD所需的引物P4和P5（表1）。以重組質粒pSTOP1622-AbnA-gtamyhds為模板，以P4、P5為引物，進行PCR擴增。PCR擴增條件為：98℃ 5 min；98℃ 20 s，60℃20 s，74℃ 30 s，30個循環(huán)；74℃，10 min。擴增產物經SacI和KpnI雙酶切，連接至經同樣雙酶切處理后的重組質粒pSTOP1622-yiappa，構建重組質粒pSTOP1622-yiappa-sbdh。采用SpeI和KpnI雙酶切重組質粒鑒定是否有外源基因的插入。

表1 構建重組質粒所用引物

1.2.3 枯草芽孢桿菌B. subtilisWB600感受態(tài)細胞的制備和轉化 枯草芽孢桿菌B. subtilisWB600感受態(tài)細胞的制備和轉化采用改進的 Spizizen 法［18］進行。

1.2.4 重組酶的誘導表達和純化 接種重組枯草芽孢桿菌單克隆到LB液體培養(yǎng)基中，用250 mL三角瓶進行培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基的裝液量為20 mL，培養(yǎng)溫度為37℃，轉速為200 r/min，培養(yǎng)時間為10 h。然后轉接該培養(yǎng)物于新鮮LB液體培養(yǎng)基中，用250 mL三角瓶進行培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基裝液量為25 mL，接種量為3%，培養(yǎng)溫度為37℃，轉速為200 r/min。當培養(yǎng)至菌體OD600nm達到1時，添加終濃度為0.5%的木糖，誘導細胞表達重組蛋白質，誘導時間為36 h。

采用Ni2+親和層析柱對發(fā)酵上清液中目的蛋白質進行純化，用200 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫，即得到純化后的重組酶。利用SDS-PAGE檢測重組蛋白質的純度，并采用Bradford法［19］測定重組蛋白質的濃度。

1.2.5 植酸酶的酶活力測定 取250 μL酶液于離心管中，加入750 μL 0.25 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH4.5），混勻。向實驗組管中加入2 mL 1.5 mmol/L 植酸鈉溶液（0.25 mol/L醋酸鈉緩沖液，pH4.5），對照組中加入2 mL顏色/終點混合液（鉬酸銨/釩酸銨/硝酸），搖勻。于37℃反應30 min后，立即向實驗組中加入2 mL顏色/終點混合液，對照組中加入2 mL 1.5 mmol/L植酸鈉溶液，并混勻，于415 nm處測定光吸收值。植酸酶活力單位（U）定義為：在37℃、pH4.5的條件下，每分鐘從1.5 mmol/L植酸鈉溶液中釋放出1 μmol/L無機磷所需要的植酸酶量為一個酶活力單位（U）。

1.2.6 植酸酶的酶學性質 植酸酶的最適反應pH：將酶液于不同pH（1.0-8.0）條件下測定植酸酶活性。所使用的緩沖液如下：0.25 mol/L 甘氨酸-鹽酸緩沖液，pH1.0-3.5；0.25 mol/L 醋酸鈉-醋酸緩沖液，pH3.5-6.0；0.25 mol/L Tris-鹽酸緩沖液，pH6.0-8.5。

植酸酶的pH穩(wěn)定性：將酶液用不同pH（1.0-12.0）緩沖液稀釋，使其在不同pH條件下于37℃處理2 h，然后用最適pH緩沖液稀釋，并根據如上反應體系測定樣品的酶活力。所使用的緩沖液如下：0.25 mol/L 甘氨酸-鹽酸緩沖液，pH1.0-3.5；0.25 mol/L 醋酸鈉-醋酸緩沖液，pH3.5-6.0；0.25 mol/L Tris-鹽酸緩沖液，pH6.0-8.5；0.25 mol/L 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，pH8.5-12.0。

為此,本文以光伏直流模塊的防孤島控制為研究對象。首先,以Boost+FB-LLC(Full Bridge LLC,FB-LLC)作為本文的直流模塊拓撲結構,并對該電路拓撲進行了工作原理分析。其次,本文分析了光伏直流模塊的孤島效應,并提出了一種基于注入電流擾動法的新型防孤島控制策略。最后,本文研制了一臺1 000 W的光伏直流模塊樣機,并完成了孤島保護實驗。

植酸酶的最適反應溫度：按照如上反應體系測定樣品的酶活力，分別于30-90℃反應30 min，測定不同溫度條件下樣品的酶活力，并以相對酶活對溫度作圖，確定其最適反應溫度。

植酸酶的動力學參數：用0.25 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH4.5）配制不同濃度的植酸鈉溶液（0.0625%、0.1%、0.125%、0.2%、0.25%、0.5%、1.0%和1.5%），分別向植酸鈉溶液中加入等量的酶液，按照1.2.5方法測定酶活。根據雙倒數作圖法以底物濃度的倒數為橫坐標，以比酶活力的倒數為縱坐標作圖，直線的斜率為Km/Vmax，截距為1/Vmax，計算以醋酸鈉為底物時的米氏常數Km、最大反應速度Vmax和反應常數kcat。

植酸酶的熱穩(wěn)定性：取250 μL酶液于離心管中，加入750 μL 0.25 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH4.5），混勻。酶液于80℃保溫0-40 min后，根據如上反應體系測定樣品的酶活力。

植酸酶的蛋白酶抗性：分別用0.25 mol/L Gly-HCl緩沖液（pH 2.0）和0.25 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.0）配制0.1 mg/mL的胃蛋白酶和胰蛋白酶。按照蛋白酶與植酸酶質量比為1∶10的比例在植酸酶中分別加入胃蛋白酶和胰蛋白酶，于37℃分別保溫2 h后，向其中加入蛋白酶抑制劑終止反應，然后對蛋白酶處理的樣品用最適pH緩沖液（0.25 mol/L醋酸鈉緩沖液，pH 4.5）進行100倍稀釋，再根據如上反應體系測定樣品的酶活力。1.2.7 重組酶的生玉米淀粉結合率 向0.1 mg/mL酶液中加入生玉米淀粉至其終濃度為0-10%，混合體系在20℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱孵育3 h，振蕩速率為180 r/min。反應結束后，測定上清中的殘余植酸酶活性。結合率AR計算公式如下：AR%=（O-R）/O×100。R：上清殘余酶活力；O：初始酶活力。

1.2.8 數據統(tǒng)計分析 以上酶學性質研究實驗中，每個實驗做3 個平行。運用軟件SigmaPlot 11.0對試驗數據進行統(tǒng)計分析并作圖，數據均以x-±s表示。

2 結果

2.1 重組質粒的酶切鑒定

采用限制性內切酶SpeI和SacI酶切質粒pSTOP1622-yiappah，采用限制性內切酶SpeI和KpnI酶切質粒pSTOP1622-yiappa-sbdh，得到大小分別約為1.3 kb和1.6 kb的兩個片段（圖1），大小與理論值相符。同時將以上重組質粒送至上海生工生物工程股份有限公司進行插入片段測序，并將測序結果（結果未顯示）與對應的基因序列進行了比對確認，證實重組質粒構建成功。

圖1 重組質粒的酶切鑒定

2.2 重組植酸酶的誘導表達與純化

圖2 重組植酸酶的SDS-PAGE檢測結果

2.3 YiAPPA-SBD和YiAPPA的酶學性質比較

圖3 pH對酶活的影響

2.3.1 pH值對重組植酸酶相對酶活的影響 將酶液于不同pH（1.0-8.0）條件下測定重組植酸酶的相對酶活，結果如圖3所示。重組植酸酶YiAPPA和YiAPPA-SBD的最適反應pH值均為4.5，并且重組植酸酶YiAPPA和YiAPPA-SBD在pH1.0-8.0范圍內具有相似的相對酶活。

2.3.2 重組植酸酶的pH穩(wěn)定性 由圖4可知，重組植酸酶YiAPPA和YiAPPA-SBD在pH1.0-12.0范圍內具有相似的穩(wěn)定性。其中，在pH1.0-3.0范圍內，重組植酸酶具有80%以上的相對酶活；在pH4.0-10.0范圍內，重組植酸酶具有90%以上的相對酶活；在pH11.0-12.0范圍內，重組植酸酶均不穩(wěn)定，很快喪失活性。

圖4 pH對穩(wěn)定性的影響

2.3.3 溫度對重組植酸酶相對酶活的影響 按照植酸酶的酶活力測定反應體系，于30-90℃下測定重組植酸酶的酶活力，以樣品的相對酶活對溫度作圖的結果如圖5所示。重組植酸酶YiAPPA和YiAPPASBD的最適反應溫度均為55℃。在30-55℃范圍內，兩者具有相似的相對酶活；在55-90℃范圍內，YiAPPA-SBD的相對酶活均高于YiAPPA的相對酶活。以上結果表明，融合酶YiAPPA-SBD的高溫活性得到提高。

2.3.4 重組植酸酶的比活力和動力學參數 重組植酸酶以植酸鈉為底物時的比活力、米氏常數Km和反應常數kcat如表2所示。與YiAPPA相比，融合酶YiAPPA-SBD的比活力、Km及kcat值均未明顯改變。即SBD在YiAPPA的C末端的融合表達未影響YiAPPA的底物結合能力和底物催化能力。

圖5 溫度對酶活的影響

2.3.5 重組植酸酶的熱穩(wěn)定性 將重組植酸酶YiAPPA和YiAPPA-SBD于80℃分別保溫不同時間，測定其相對酶活，比較兩者的熱穩(wěn)定性，結果如圖6所示。在80℃下，融合酶YiAPPA-SBD的熱穩(wěn)定性明顯高于YiAPPA的熱穩(wěn)定性。其中YiAPPA于80℃的半衰期約為15 min，YiAPPA-SBD于80℃的半衰期約為30 min，提高了2倍。

圖6 80℃重組植酸酶的熱穩(wěn)定性

表2 37℃重組植酸酶的比活力及動力學參數

2.3.6 重組植酸酶對蛋白酶的抗性 向重組植酸酶樣品中分別加入胃蛋白酶和胰蛋白酶，于37℃分別保溫2 h后，測定樣品的剩余酶活力。表3中結果顯示，重組植酸酶YiAPPA和YiAPPA-SBD對蛋白酶具有相近的抗性。重組植酸酶經胃蛋白酶處理后仍保留有84%以上的相對酶活；重組植酸酶經胰蛋白酶處理后仍保留有82%以上的相對酶活。

表3 重組植酸酶對蛋白酶的抗性

2.3.7 重組植酸酶對生玉米淀粉的結合率 向重組植酸酶樣品中加入不同濃度的生玉米淀粉，待孵育結束后測定重組植酸酶對生玉米淀粉的結合率，結果如圖7所示。在生玉米淀粉濃度為0-10%的條件下，重組植酸酶YiAPPA對生玉米淀粉的結合率為0；融合酶YiAPPA-SBD對生玉米淀粉的結合率隨著生玉米淀粉濃度的增加而提高。當生玉米淀粉濃度大于8%時，YiAPPA-SBD對其結合率達到80%以上。

圖7 重組植酸酶對生玉米淀粉的結合率

2.3.8 生玉米淀粉對重組植酸酶相對酶活的影響 向0.1 mg/mL重組植酸酶中加入生玉米淀粉至其濃度為0、15%、30%、45%和60%，混合體系在20℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱孵育3 h，然后取1 mL酶液樣品直接加入底物進行植酸酶的酶活力測定，以樣品的相對酶活對反應體系中生玉米淀粉終濃度作圖的結果如圖8所示。在生玉米淀粉存在的條件下，未結合生玉米淀粉的YiAPPA與結合了生玉米淀粉的YiAPPA-SBD的相對酶活基本一致，這表明生玉米淀粉的結合不影響融合酶的植酸酶活性。

圖8 生玉米淀粉對重組植酸酶相對酶活的影響

3 討論

目前商業(yè)化植酸酶主要是來源于真菌和細菌，如來源于黑曲霉A. niger的植酸酶PhyA、來源于大腸桿菌Escherichia coli的植酸酶AppA和AppA2、來源于Citrobacter braakii的植酸酶 CbAppA［5］。但是這些商業(yè)化植酸酶具有熱穩(wěn)定性差、酶活低、pH作用范圍窄等缺點。例如，飼用酶在飼料的造粒過程中一般需要經過一個75-93℃的短暫高溫。A.nigerPhyA經70℃處理20 min后僅殘留30%的活性，在此溫度范圍內易失活，酶活性大大降低；添加在飼料中的植酸酶，最終的作用場所是動物的胃腸道，主要場所是胃，降解時的pH為1.8-3.5。A.nigerPhyA的最適pH值分別是pH 2.5 和5.5，在兩個峰值之間的酶活相對偏低。商業(yè)化植酸酶的這些缺點不利于植酸酶在飼料工業(yè)的推廣與應用。研究者已致力于采用分子生物學手段改造這些植酸酶的酶學性質，并取得了較好的研究結果。Zhang等［20］對比分析了A. nigerPhyA和具有優(yōu)良熱穩(wěn)定性的A.fumigatusAfp的三級結構，采用定點突變向PhyA中引入Afp中對應的氨基酸殘基，獲得了變性溫度提高7℃的突變體A58E/P65S/Q191R/T271R。Kim等［21］采用易錯PCR來提高E.ColiAppA2的熱穩(wěn)定性，獲得了熱變性溫度提高6-7℃的兩個突變體K64E和 K65E/K97M/S209G。Sanchez-Romero等 向來源于Citrobacter braakii的植酸酶CbAppA中引入3對二硫鍵，使其變性溫度提高了12.1℃［22］。Tian等［23］對比了多種不同植酸酶的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)第53位和第91位氨基酸殘基具有較強可變性。來源于A. niger113的植酸酶PhyI 1s與來源于A. nigerNRRL 3135的植酸酶PhyA的氨基酸序列的相似性高達98%，但PhyI 1s的活性僅為PhyA的1/10。他們將PhyI 1s中第53位和第91位氨基酸殘基突變?yōu)镻hyA中對應的氨基酸殘基，獲得了催化效率（kcat/Km）分別提高了4.08倍的突變體Q53R和2.84倍的突變體 K91R。Ushasree等［24］對來源于A. nigerNII 08121的植酸酶進行定點突變，獲得了最適pH為3.2的突變體P212H。

嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶GTamy具有優(yōu)良的高溫活性和熱穩(wěn)定性，其最適反應溫度為80℃，于80℃的半衰期為184 min，其活性和熱穩(wěn)定性均不依賴于Ca2+［25］。GTamy屬于糖苷水解酶類的第13家族，具有第13家族酶分子結構和催化機制上的共同特征，如保守區(qū)域、保守的催化活性中心、金屬離子結合位點和3個結構域等［25］。GTamy的結構域C作為生淀粉結合域SBD，是其直接水解未經糊化處理的玉米淀粉的關鍵［25］。SBD作為淀粉酶的天然部分主要有以下作用：使淀粉酶分子可以在溶液中與不溶性底物（淀粉顆粒）結合，將底物運送到催化結構域的活性位點以及使淀粉顆粒表面破裂［26-29］。除此之外，SBD還具有一些特殊功能。例如，Gt-amyⅡ的SBD還與其熱穩(wěn)定性相關［30］；AmyP的SBD與其可溶性淀粉酶活相關［31］。已有研究表明SBD與異源蛋白質的融合表達會對異源蛋白質的酶學性質產生影響。例如，Hua等［32］將來源于Bacillus stearothermophilus的亮氨酸氨肽酶LAPII與來源于Bacillussp. TS-23的α-淀粉酶的生淀粉結合域SBD進行融合表達，獲得了高溫活性和熱穩(wěn)定性均得到提高的融合酶LAPsbd。

本研究通過在植酸酶YiAPPA的C末端融合嗜熱酸性α-淀粉酶GTamy的生淀粉結合域SBD，獲得了熱穩(wěn)定性和高溫活性均得到提高的融合酶YiAPPA-SBD。這表明將GTamy-SBD與YiAPPA進行融合表達，有利于維持YiAPPA高溫條件下的結構穩(wěn)定性。并且融合酶YiAPPA-SBD仍保留YiAPPA的其它優(yōu)良酶學性質，如其最適反應條件為55℃、pH4.5，37℃的絕對酶活約為3 900 U/mg，并具有優(yōu)良的pH穩(wěn)定性和蛋白酶抗性。熱穩(wěn)定性和高溫活性均得到提高的融合酶YiAPPA-SBD較YiAPPA更適于飼料工業(yè)的應用。此外，融合酶YiAPPA-SBD具有玉米淀粉結合能力，而且生玉米淀粉的結合不影響融合酶的植酸酶活性，這表明植酸酶YiAPPA和生淀粉結合域SBD均能獨立發(fā)揮功能。接下來我們將根據這一特點，探索利用玉米淀粉吸附法一步純化發(fā)酵上清液中融合酶YiAPPA-SBD的條件，從而簡化融合酶YiAPPA-SBD的生產工藝。

4 結論

本研究獲得了高溫活性和熱穩(wěn)定性均得到提高的融合酶YiAPPA-SBD，其于55-90℃范圍內的相對酶活均高于YiAPPA的相對酶活，于80℃的半衰期提高約2倍。并且融合酶YiAPPA-SBD獲得了對生玉米淀粉的結合能力，在生玉米淀粉濃度＞8%的條件下，YiAPPA-SBD對其結合率達到80%以上。此外，融合酶YiAPPA-SBD保留有YiAPPA的其他優(yōu)良酶學性質，最適反應pH為4.5，37℃的絕對酶活高達3 900 U/mg，并具有優(yōu)良的pH穩(wěn)定性和蛋白酶抗性。

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