鄧超 杜秀娟 黃濤 郭英 李炳學(xué) 卜寧

（1. 沈陽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，沈陽 110034；2. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，沈陽 110866）

生物固氮是自然生態(tài)系統(tǒng)中氮的主要來源，陸地生態(tài)系統(tǒng)中通過生物固氮輸入的氮約110 Tg/a，對全球生態(tài)系統(tǒng)氮素循環(huán)平衡起著關(guān)鍵作用［1］。固氮菌在自然界分布十分廣泛，可固定空氣中的游離氮轉(zhuǎn)變?yōu)樯锟梢岳玫牡兀痰磻?yīng)是地球上氮素的重要來源。有些固氮菌分泌一些植物激素，促進植物根系生長和對水分及礦物質(zhì)的吸收［2-4］。過量氮肥的施用抑制土壤中固氮菌的固氮作用，減弱了固氮菌的氮素營養(yǎng)競爭優(yōu)勢，固氮種群呈下降趨勢。在減施氮肥的國家調(diào)控戰(zhàn)略條件下，利用固氮菌資源保持玉米穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)成為重要途徑。本研究以沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)棕壤長期定位試驗站玉米栽培土壤為樣品來源，分離目標(biāo)固氮菌。

固氮菌為保障固氮酶在低氧條件發(fā)揮作用，經(jīng)常依靠分泌胞外多糖控制進入細(xì)胞的氧濃度。胞外多糖還有助于固氮菌抵抗?fàn)I養(yǎng)、干燥、不良環(huán)境等脅迫，有利于菌體定值在植物根部，所以本研究將高產(chǎn)胞外多糖作為篩選固氮菌的一個重要指標(biāo)，以期達(dá)到獲得利于固氮菌體，使減施氮肥土壤補充保持玉米等作物穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)需求的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 供試土壤采集于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)棕壤長期定位試驗站（北緯40°48'，東經(jīng)123°33'）。1.1.2 培養(yǎng)基 阿須貝（Ashby）培養(yǎng)基：KH2PO4（0.2g），NaCl（0.2g），CaCO3（5.0g），CaSO4·2H2O（0.1g），MgSO4·7H20（0.2g），葡萄糖（10.0g），瓊脂粉（20.0g）溶于1 000 mL蒸餾水中，pH7.2。LB培養(yǎng)基：酵母浸粉5.0 g，NaCl 10.0 g，蛋白胨 10.0 g，瓊脂粉20.0 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，pH7.0。牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂 20.0 g，pH 6.0。優(yōu)化培養(yǎng)基：蔗糖20.0 g，牛肉膏 2.0 g，KH2PO40.4 g、MgSO4·7H2O 0.4 g、NaCl 0.4 g、CaSO4·2H2O 0.4 g 和 CaCO32.0 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，pH7.0。

生理生化試驗用培養(yǎng)基。淀粉培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，可溶性淀粉2.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20.0 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，pH7.0。

葡萄糖蛋白胨水溶液培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，葡萄糖5.0 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，pH7.0-7.2。M.R.反應(yīng)中，所用試劑為甲基紅（甲基紅0.1 g，95%乙醇300 mL，蒸餾水200 mL）。

檸檬酸鹽培養(yǎng)基：NH4H2PO40.5 g，檸檬酸鈉2.0 g，MgSO4

.7H2O 0.2 g，NaCl 1.0 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，0.04% 酚紅液溶液20 mL，pH6.8。將上述營養(yǎng)物質(zhì)溶解后，將pH調(diào)節(jié)至6.8，加入指示劑制成黃綠色溶液后，分裝到試管中，121℃濕熱滅菌30 min。

糖發(fā)酵培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.2 g，（NH4）2-HPO41.0 g，KCl 0.2 g，碳水化合物（葡萄糖和蔗糖）10.0 g，酵母浸粉0.2 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，0.04%溴甲酚紫15 mL，pH7.0-7.2。

1.2 方法

1.2.1 土樣的采集 土壤樣品采集時去掉土壤表層的作物殘茬，采集深度為0-20 cm。從試驗站取得的新鮮土壤樣品分別標(biāo)記并放入已滅菌的塑封袋中，封口，于4℃冰箱中保存。

1.2.2 固氮菌的分離篩選 取采集的新鮮土壤樣品10 g，放入盛有90 mL無菌水并帶有少量小玻璃珠的三角瓶中，180 r/min振蕩培養(yǎng)30 min，制成10-1懸濁液，并依次稀釋到10-6。選取10-3、10-4和10-5三個稀釋梯度的懸濁液，分別吸取0.1 mL稀釋液在分離用阿須貝（Ashby）培養(yǎng)基上均勻涂布，置于30℃恒溫培養(yǎng)5-7 d，每個梯度設(shè)置3次重復(fù)。待平板上微生物菌落長出后，挑取單菌落，劃線轉(zhuǎn)接于分離用選擇性培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)5-7 d。依此方法連續(xù)劃線純化培養(yǎng)，直至獲得純撇楊，劃線于試管斜面，于4℃冰箱保藏備用。

1.2.3 粗多糖的提取 得到的純化菌株轉(zhuǎn)接至裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，180 r/min，37℃活化24 h。吸取1 mL已活化的菌株接入裝有50 mL新鮮的液體LB培養(yǎng)基的三角瓶中，180 r/min，37℃培養(yǎng)48 h，得發(fā)酵液。取10 mL發(fā)酵液，5 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，加入兩倍體積95%無水乙醇，用玻璃棒均勻攪拌至出現(xiàn)絮狀沉淀，靜置于4℃冰箱中沉淀24 h；10 000 r/min離心15 min得多糖沉淀，自然風(fēng)干，稱重。

1.2.4 菌株鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：將菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上進行劃線，30℃培養(yǎng)48 d后，對菌落的生長情況、菌落形狀、大小、透明度、顏色、光滑度、邊緣特征、凹凸度、是否隆起等生物學(xué)形狀進行觀察，并挑取少量已活化的菌落于載玻片上進行涂片，固定。對菌株進行簡單染色后用光學(xué)顯微鏡觀察，對細(xì)胞大小、形狀等特征進行觀察和記錄。生理生化鑒定：參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》（第8版）的方法，對菌株進行部分生理生化鑒定。分子生物學(xué)鑒定：用細(xì)菌基因組快速提取試劑盒提取菌株的基因組DNA。以菌株的基因組為模板，以27F和1492R為引物，采用50 μL PCR反應(yīng)體系進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行同源性序列分析與比對。根據(jù)測序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 生長條件優(yōu)化 WN-F菌株生長曲線的測定：將活化后的菌液接入50 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，180 r/min，37℃條件下培養(yǎng)。每隔2 h測定菌液OD600值，直至OD值趨于穩(wěn)定，作3組對照。

碳、氮源對WN-F菌株生長的影響：在無機鹽培養(yǎng)基中分別加入2%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖，再分別加入0.1%（NH4）2SO4、磷酸二氫銨、牛肉膏、蛋白胨和酵母浸粉，以不加碳源為對照，接種0.5 mL母液，37℃，180 r/min培養(yǎng)24 h，測定菌體濃度，每組處理設(shè)3個重復(fù)，以篩選最佳碳氮源組合。

正交試驗設(shè)計：以最佳碳氮源組合（蔗糖和牛 肉 膏 ）、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl、CaSO4·2H2O和CaCO3共7個因素，設(shè)計7因素3水平正交試驗，測定WN-F菌株的最優(yōu)培養(yǎng)條件；多糖的提取采用乙醇沉淀法。

1.2.6 菌株固氮與產(chǎn)糖關(guān)系 配置優(yōu)化培養(yǎng)基，氮源（牛肉膏）分別加入0%、0.5%、1%、1.5%和2%濃度，接種1%活化菌液，37℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。每組作3個重復(fù)，以空白培養(yǎng)基為對照。分別測定菌體OD600值及產(chǎn)糖量。

2 結(jié)果

2.1 固氮菌篩選結(jié)果

通過分離純化得到2株在不同土樣中均大量存在的菌株WN-E、WN-F。對2菌株產(chǎn)糖能力測定分析表明，相同條件下培養(yǎng)24 h，10 mL發(fā)酵液WN-E產(chǎn)糖量為0.06 g，WN-F產(chǎn)糖量為0.08 g，由此，以產(chǎn)糖相對較高的WN-F菌株開展后續(xù)研究。

2.2 WN-F菌株的鑒定

2.2.1 WN-F菌株形態(tài)學(xué)觀察 WN-F菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長良好，菌落較大，菌苔較厚，菌落濕潤光滑，透明，圓形或近似圓形，邊緣整齊且清晰，濕潤有光澤，菌落中央凸起，呈乳白色（圖1-A）。WN-F菌體呈長桿狀，兩端圓形，多排列成長短不一的鏈狀，也有單個分散排列（圖1-B）。

圖1 WN-F菌落形態(tài)（A）WN-F菌體形態(tài)放大1600倍（B）

2.2.2 WN-F菌株生理生化特性 WN-F菌株部分生理生化特性試驗結(jié)果見表1。

表1 WN-F生理生化特性

2.2.3 WN-F菌株分子生物學(xué)鑒定 WN-F菌株測序長度為1 496 bp，經(jīng)BLAST比對，該菌株與芽孢桿菌屬的16S rDNA的同源性高達(dá)99%，結(jié)合生理生化及生物學(xué)特性試驗結(jié)果，判定WN-F為芽孢桿菌屬，命名為Bacillussp. WN-F。利用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)樹，如圖2所示。

2.3 WN-F菌株生長條件優(yōu)化

2.3.1 WN-F菌株生長曲線 如圖3所示，菌株在接種0-4 h內(nèi)處于遲緩期，之后進入對數(shù)期，此階段菌株生長較快，12 h開始生長緩慢，到32 h趨于穩(wěn)定。

2.3.2 碳、氮源對WN-F菌株生長的影響 利用酶標(biāo)儀測定菌體在不同碳、氮源條件下生長OD600值，結(jié)果（表2）顯示，該菌株在以蔗糖為碳源、以牛肉膏為氮源的情況下生長情況最好。

2.3.3 WN-F菌株培養(yǎng)基優(yōu)化 設(shè)計的7因素3試驗結(jié)果見表3。根據(jù)R值大小可得各因素作用的主次順序為磷酸二氫鉀＞碳酸鈣＞二水硫酸鈣＞氯化鈉＞牛肉膏＞七水硫酸鎂＞蔗糖。

圖2 WN-F菌16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 WN-F菌株生長曲線

表2 不同碳、氮源條件下生長OD600 值

由上述無機鹽培養(yǎng)基正交試驗結(jié)果中的各列K值可知：碳源蔗糖的最適濃度為A2，氮源牛肉膏的最適濃度為B3，磷酸二氫鉀的最適濃度為C3，七水硫酸鎂的最適濃度為D2，氯化鈉的最適濃度為E3，二水硫酸鈣的最適濃度為F3，碳酸鈣的最適濃度為G3。

由測定結(jié)果可知，WN-F菌株最佳培養(yǎng)基的配方為（L-1）：蔗糖20.0 g，牛肉膏 2.0 g，KH2PO40.4 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，NaCl 0.4 g，CaSO4·2H2O 0.4 g和 CaCO32.0 g。

2.4 WN-F菌株固氮與產(chǎn)糖關(guān)系測定

阿氏芽孢桿菌WN-F在24 h時，不同初始濃度氮源的產(chǎn)糖量成拋物線形（圖4）。在無氮條件下，菌株生長繁殖需要固氮，消耗能量大，積累少量多糖；WN-F在適宜碳氮比（葡萄糖20 g/牛肉膏1 g）條件下，有利于胞外多糖合成；當(dāng)牛肉膏氮源含量2%時，菌體生長繁殖速度快，產(chǎn)糖量急劇下降。

3 討論

目前發(fā)現(xiàn)的幾種產(chǎn)多糖微生物及其多糖如出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans），主要產(chǎn)普魯蘭糖［5］，黃單胞菌（Xanthomonas campestris）經(jīng)過發(fā)酵產(chǎn)生黃原膠［6］，土壤桿菌（Agrobacteriumsp.）經(jīng)過發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖叫做熱凝膠［7］，鏈球菌屬（Streptococcusspp.）能產(chǎn)透明質(zhì)酸（即玻尿酸），伊樂假單胞菌（Pseudomonas elodea）能產(chǎn)生結(jié)冷膠［8-9］，腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）經(jīng)過發(fā)酵合成右旋糖酐［10］，芽孢桿菌屬（Bacillussp.）經(jīng)過發(fā)酵產(chǎn)生生物絮凝劑。常見的產(chǎn)多糖土壤微生物有土壤桿菌屬、醋酸桿菌屬、固氮菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬及根瘤菌屬等。

表3 WN-F菌株的正交試驗

圖4 WN-F不同初始氮濃度產(chǎn)糖

許多研究表明，植物中多糖含量不僅與植株本身有關(guān)，與固氮菌接種量，氮施用等均有關(guān)系［11-13］。施肥對固氮微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)有顯著的影響，高氮水平會降低生態(tài)系統(tǒng)對固氮菌的依賴性，抑制固氮效果。如 Silva等［14］發(fā)現(xiàn)增加銨態(tài)氮和硝態(tài)氮會降低荷蘭地區(qū)不同質(zhì)地的農(nóng)耕土壤中nifH基因的拷貝數(shù)。在澳大利亞放牧林地土壤中，固氮酶活性和nifH基因豐度與總氮量呈負(fù)相關(guān)［15］。在巴西種植高粱的土壤中，非共生固氮菌的豐度在低氮水平下比高氮水平下高30%［16］。對長江三角洲平原典型水稻土壤研究也發(fā)現(xiàn)，固氮微生物的豐度和群落結(jié)構(gòu)與速效 N 含量呈負(fù)相關(guān)，氮肥會抑制固氮微生物的生長，顯著降低水田 α 變形菌綱固氮微生物的相對豐度［17］。糖類積累的主要過程是碳代謝過程，而碳代謝與氮代謝相互依存和限制。兩種生理過程之間的聯(lián)系是α-酮戊二酸與NH4+在谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合成酶的聯(lián)合催化。因此，氮供應(yīng)在調(diào)節(jié)糖類積累中起重要作用［18-19］。

本研究結(jié)果表明，固氮阿氏芽孢桿菌 WN-F在適宜碳氮比條件下，有利于胞外多糖合成。合成胞外多糖有利于菌體固氮，說明該菌株有望在1%-1.5%氮源存在下固氮，使其在適量施用氮肥的土壤中保持固氮活性，將為減施氮肥土壤補充保持玉米等作物穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)需求的氮素。

4 結(jié)論

在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)棕壤長期定位試驗站采集的土樣中，篩選出1株產(chǎn)糖較高的固氮菌WN-F。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，命名為阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）WN-F。該菌株在12 h時達(dá)到最佳生長點，在24 h時產(chǎn)糖量趨于平穩(wěn)，產(chǎn)糖量隨著初始氮濃度的增加呈現(xiàn)拋物線形變化。

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