許艷俊 李靜媛

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，太谷 030801；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266109）

酵母菌在工業(yè)領(lǐng)域中的許多方面發(fā)揮著重要的作用，但工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境對(duì)于酵母并非最佳的生理環(huán)境，基中包括葡萄酒的釀造環(huán)境［1］。在發(fā)酵過(guò)程中酵母會(huì)受到各種環(huán)境因素的影響，目前已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了單一環(huán)境條件對(duì)酵母的影響，如溫度、酒精、滲透壓等［2］。但實(shí)際生產(chǎn)中酵母菌面對(duì)的環(huán)境通常是由幾種因素共同作用的［3］。通過(guò)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，目前對(duì)兩種或兩種以上環(huán)境因素共同作用的研究相對(duì)較少［4］。

較低的pH 值（通常低于4）是酵母所面臨的主要脅迫［5］。培養(yǎng)液中的pH值，即氫離子濃度會(huì)影響酵母原生質(zhì)膜所帶的電荷，引起原生質(zhì)膜對(duì)某些離子滲透性的改變，從而影響酵母細(xì)胞對(duì)某些重要離子的吸收［6］。

無(wú)機(jī)離子（如Ca2+、Mg2+、Zn2+和K+等）是酵母細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的營(yíng)養(yǎng)元素［7］，其中Ca2+在保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整，穩(wěn)定細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)酶的活性等方面發(fā)揮重要的作用［8］。除此之外，作為第二信使，由鈣調(diào)蛋白（Ca2+/calmodulin）調(diào)控的生物信號(hào)傳導(dǎo)在細(xì)胞應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力時(shí)起著關(guān)鍵作用［9］。目前研究表明Ca2+的存在可以緩解發(fā)酵過(guò)程中酒精脅迫所帶來(lái)的毒害作用。前期的研究亦得到同樣的結(jié)論，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Ca2+可以提高質(zhì)膜H+-ATPase 的活性［10］。質(zhì)膜 H+-ATPase是細(xì)胞質(zhì)膜上的一種重要功能蛋白，其活性依賴(lài)于介質(zhì)陽(yáng)離子的濃度，如 Mg2+、K+、Ca2+等［11］。H+-ATPase 能水解ATP產(chǎn)生能量，利用水解ATP產(chǎn)生的能量將細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的H+泵到質(zhì)膜外側(cè)，產(chǎn)生跨膜pH梯度，起到平衡pH的作用［12］。

因此，Ca2+在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外H+濃度（pH）方面起著重要的作用［13］。前人的研究表明，培養(yǎng)基中pH和K+的相互作用是影響發(fā)酵進(jìn)程的一個(gè)關(guān)鍵因素，當(dāng)發(fā)酵液中pH值和K+的含量均很低時(shí)，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵不徹底；而且只有當(dāng)pH較低的條件下，K+的促進(jìn)作用才會(huì)表現(xiàn)出來(lái)［14］。Ca2+和pH值協(xié)同作用對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的影響目前還未見(jiàn)報(bào)道。

本文研究Ca2+和pH相互作用對(duì)酵母代謝的影響，并從酵母細(xì)胞膜通透性和完整性的角度探討影響酵母細(xì)胞的代謝的機(jī)制，更加系統(tǒng)地闡述Ca2+和pH協(xié)同作用對(duì)酵母細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株Saccharomyces cerevisiaeAWRI R2是一株商業(yè)葡萄酒釀酒酵母，由Marivin（Australian）公司商業(yè)化，具有良好的發(fā)酵性能［15］。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）YPD培養(yǎng)基：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%。（2）模擬葡萄汁培養(yǎng)基：葡萄糖10%，果糖10%，KH2PO40.5%，MgSO4·7H2O 0.04%， 酵 母 膏 0.1%（ 于 121℃ 滅 菌 20 min），（NH4）2SO40.2%。模擬葡萄汁培養(yǎng)基是一種模擬標(biāo)準(zhǔn)葡萄汁的組成成分，且成分確定的培養(yǎng)基，利用此培養(yǎng)基可以保證培養(yǎng)條件的一致性，為實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性提供保證［16］。

1.1.3 試劑 高效液相的標(biāo)樣購(gòu)自Sigma（Castle Hill，NSW，Australia），為色譜純；葡萄糖、果糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、酵母膏、（NH4）2SO4、蛋白胨、鹽酸，氫氧化鈉、丙酮、CaCl2、DNS試劑、二乙酸熒光素（FDA）溶液、碘化丙錠（PI）溶液均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌發(fā)酵條件的確定

1.2.1.1 酵母菌接種量的確定 pH確定在3.0，Ca2+濃度選擇 1×10-1、1×10-4mol/L，接種量選擇 1×106、4×106、1.2×107CFU/mL， 進(jìn) 行 6組 發(fā) 酵 實(shí) 驗(yàn)。28℃、120 r/min搖床培養(yǎng)，定期取樣，測(cè)定殘?zhí)呛?，根?jù)結(jié)果確定接種量［17］。

1.2.1.2 pH和Ca2+處理水平的確定 在確定的接種量下，Ca2+濃度選擇1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4mol/L，pH設(shè)定在 3.0、3.25、3.5，進(jìn)行 12組發(fā)酵試驗(yàn)。28℃、120 r/min搖床培養(yǎng)，定期取樣，測(cè)定殘?zhí)呛?，根?jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定pH（L1）和Ca2+（La、Lb）的處理水平。

1.2.2 pH和Ca2+的協(xié)同作用對(duì)酵母的作用 實(shí)驗(yàn)選取6個(gè)不同的發(fā)酵體系（表1），（Ca2+濃度為0時(shí)記為L(zhǎng)c，pH為5.5時(shí)記為L(zhǎng)2）將菌液分別接入不同的發(fā)酵體系中，28℃、120 r/min搖床培養(yǎng)，定期取樣考查CO2釋放量和殘?zhí)呛俊?/p>

1.2.2.1 CO2釋放量的測(cè)定 每天同一時(shí)間對(duì)所有發(fā)酵瓶進(jìn)行稱(chēng)重，得出每天CO2的釋放量［18］。

1.2.2.2 殘?zhí)呛康臏y(cè)定 將培養(yǎng)至各時(shí)間點(diǎn)的模擬葡萄汁發(fā)酵培養(yǎng)液置于超凈工作臺(tái)中取樣5 mL，離心得上清液進(jìn)行檢測(cè)。參照Ciani等［19］的方法，發(fā)酵液中葡萄糖和果糖的含量采用高效液相色譜法（Waters-2695），色譜條件：Bio-Rad HPX-87H 色譜柱（300 mm×7.8 mm），示差檢測(cè)器（RID，waters-2414）。柱溫65℃，流速0.6 mL/min，等度洗脫，進(jìn)樣量10 μL，以峰面積外標(biāo)法定量。流動(dòng)相為0.005 mol/L H2SO4，經(jīng)溶劑過(guò)濾器過(guò)濾，濾膜為 0.22 μm水相膜（四氟乙烯膜）。

表1 不同發(fā)酵體系的設(shè)定

1.2.3 pH和Ca2+水平對(duì)酵母細(xì)胞膜的通透性的影響

1.2.3.1 電導(dǎo)率的測(cè)定 定期量取培養(yǎng)基測(cè)定電導(dǎo)率。將電導(dǎo)率儀探測(cè)頭沒(méi)入培養(yǎng)液中，待電導(dǎo)率儀顯示屏上的數(shù)值穩(wěn)定時(shí)即可讀數(shù)，記錄數(shù)據(jù)［21］。

1.2.3.2 核酸和蛋白質(zhì)的測(cè)定 將發(fā)酵液于80℃水浴5 min滅酶，取經(jīng)處理的發(fā)酵液在3 000 r/min離心20 min，取上清液0.2 mL，然后用紫外分光光度計(jì)分別在260 nm和280 nm下測(cè)定核酸和蛋白質(zhì)的含量［22］。

1.2.4 pH和Ca2+水平下研究酵母細(xì)胞膜的完整性 取處于指數(shù)期的發(fā)酵液2 mL，5 000 r/min離心10 min，蒸餾水清洗一次，然后加入乙二酸熒光素（FDA）20 μL，振蕩混合均勻后加入60 μL碘化丙錠（PI）和920 μL無(wú)菌水；在室溫下避光放置5 min保證染色徹底；染色后在5 000 r/min離心5 min，用蒸餾水清洗1-2次，棄去上清液；最后用蒸餾水懸浮細(xì)胞，涂片。用熒光顯微鏡觀察、拍照和檢測(cè)，保存圖片［23］。染色時(shí)加入的乙二酸熒光素，保證其終濃度為100 μg/mL，加入的碘化丙錠，保證其終濃度為 60 μg/mL。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行，試驗(yàn)結(jié)果利用excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和作圖，0.05顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 接種量的確定

在確定的pH值和Ca2+濃度下，設(shè)定不同的接種量。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定培養(yǎng)基中殘?zhí)呛?，?shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

在 pH 為 3.0，Ca2+濃度分別為 1×10-1、1×10-4mol/L時(shí)，3個(gè)不同濃度接種量呈現(xiàn)的耗糖趨勢(shì)大致相同，如圖1所示。接種量為1×106CFU/mL時(shí)，培養(yǎng)基中糖消耗的最慢；接種量為4×106CFU/mL和1.2×107CFU/mL時(shí)，培養(yǎng)基中糖消耗的速度依次增加，說(shuō)明不同的接種量對(duì)酵母的代謝具有明顯的影響作用。為了更好的控制代謝速度，選擇接種量為 1×106CFU/mL。

比較圖1-A和B可以看出，不同的Ca2+濃度下，消耗還原糖的速度表現(xiàn)出不同。當(dāng)Ca2+濃度為1×10-1mol/L時(shí)，在前4 d培養(yǎng)基中糖消耗比較快，第4天還原糖基本耗盡；而當(dāng)Ca2+濃度為1×10-4mol/L時(shí)，在前2 d培養(yǎng)基中糖消耗比較快，之后以相對(duì)平穩(wěn)的速度下降，到第7天才基本消耗完。這說(shuō)明較高濃度的Ca2+可以促進(jìn)酵母菌的代謝。

圖1 酵母菌接種量的確定

2.2 Ca2+濃度的確定

從圖2可以看出在接種量和pH值相同的情況下，隨著Ca2+的加入，酵母糖代謝的速度加快。但Ca2+濃度為1×10-1、1×10-2mol/L的發(fā)酵體系中耗糖速度差異較小。為了獲得較大的處理差異，最終確定Ca2+濃度為1×10-2、1×10-4mol/L。比較3個(gè)圖可以看出，不同pH下消耗還原糖的速度基本相似。都是在發(fā)酵第4天還原糖基本消耗完。pH值越低，還原糖在最初消耗的越快。且隨著Ca2+濃度的增加，酵母代謝糖越快。說(shuō)明Ca2+起到了一定的緩解作用。

圖2 Ca2+濃度的確定

2.3 pH值的確定

在接種量和Ca2+濃度確定的條件下，pH為3.0的培養(yǎng)基中耗糖速度最慢；pH為3.25和pH為3.5的培養(yǎng)基中酵母耗糖速度逐漸增加，但差距較小（圖3）。結(jié)合圖2結(jié)果，為了獲得較大的處理差異，確定pH值為3.0。

根據(jù)最適pH值（5.5）以及最終確定的pH（3.0）和Ca2+濃度（0、1×10-2、1×10-4mol/L）設(shè)定不同的發(fā)酵體系，如表2所示。

2.4 pH和Ca2+共同作用對(duì)酵母代謝的作用

2.4.1 CO2釋放量 由圖4可以看出，在未添加Ca2+的體系中，pH5.5條件下的CO2釋放率比pH3.0的條件下快，使CO2的釋放早2-3 d結(jié)束。結(jié)果表明低pH值明顯抑制了酵母細(xì)胞的代謝。

相同Ca2+濃度不同pH下CO2的釋放量的情況如圖5所示。當(dāng)pH為3.0時(shí)，CO2代謝速率減慢。比較圖5-A和B可以看出，隨著Ca2+的加入，不同pH值對(duì)CO2代謝的影響差距逐漸縮小，即隨著Ca2+濃度的增大，pH的影響出現(xiàn)微弱的減弱趨勢(shì)，從而可以得出Ca2+有助于緩解低pH所帶來(lái)的生理毒害作用，并且濃度越大，緩解作用越明顯。

圖3 pH的確定

表2 不同發(fā)酵體系的設(shè)定

比較圖6-A和B可以看出在低pH環(huán)境中，Ca2+對(duì)CO2釋放速率具有明顯的促進(jìn)作用。而當(dāng)酵母生長(zhǎng)在較適pH環(huán)境中，Ca2+的促進(jìn)作用不明顯。

圖4 Ca2+濃度為0時(shí)不同pH對(duì)CO2釋放率的影響

圖5 相同Ca2+濃度、不同pH值對(duì)CO2釋放率的影響

由圖7可以看出，酵母在pH為3.0，Ca2+濃度為1×10-2mol/L的發(fā)酵體系中，CO2的代謝速率與在pH為5.5的體系中代謝速率無(wú)明顯差異（P＞0.05）。結(jié)果表明Ca2+可以加快酵母細(xì)胞CO2代謝速率和緩解pH的毒害作用，可基本抵消pH的脅迫作用。

2.4.2 還原糖的測(cè)定 如圖8-A所示，與CO2代謝相同，在未添加Ca2+的體系中，pH為5.5時(shí)酵母細(xì)胞耗糖速率較快。同樣證明低pH不利于酵母代謝。比較圖8-B和圖C看出隨著Ca2+濃度的增大，不同的pH對(duì)糖代謝影響的差距逐漸減小，同樣說(shuō)明Ca2+有助于緩解低pH所帶來(lái)的生理毒害作用，并且濃度越大，緩解作用越明顯。

圖6 相同pH、不同Ca2+濃度對(duì)CO2釋放率的影響

圖7 pH和Ca2+對(duì)CO2釋放率的影響

比較圖9-A和B，與CO2代謝特征一致，當(dāng)酵母生長(zhǎng)在較適pH環(huán)境中，Ca2+對(duì)酵母細(xì)胞的糖代謝沒(méi)有明顯影響。

由圖10可以看出，酵母在pH為3.0，Ca2+濃度為1×10-2mol/L 的發(fā)酵體系中糖的代謝速率比在pH為5.5的體系中代謝速率要慢（P＜0.05）。結(jié)果表明在糖代謝方面，Ca2+雖然可以緩解pH的毒害作用，但不能抵消pH的脅迫作用。

綜上結(jié)果表明pH和Ca2+對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)表現(xiàn)出協(xié)同作用。在較適pH下，Ca2+對(duì)酵母代謝的促進(jìn)作用不明顯。而當(dāng)pH較低時(shí)，Ca2+表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用，即Ca2+可緩解pH的毒害作用，但不能完全抵消其脅迫作用。

圖8 相同Ca2+濃度、不同pH對(duì)糖利用的影響

2.5 pH和Ca2+對(duì)酵母細(xì)胞膜通透性的作用

不同發(fā)酵體系中的發(fā)酵液電導(dǎo)率如圖11所示。相同Ca2+濃度下，相比pH5.5，pH3.0的發(fā)酵體系中電導(dǎo)率值明顯降低，說(shuō)明低pH值降低酵母細(xì)胞膜的通透性。在pH為3.0時(shí)，隨著Ca2+濃度的增加，電導(dǎo)率值顯著增加，且增長(zhǎng)幅度較大，表明細(xì)胞膜的通透性顯著增加。在pH為5.5時(shí)，隨著Ca2+濃度的增加，電導(dǎo)率值增長(zhǎng)較為緩慢，說(shuō)明當(dāng)pH不是脅迫條件的情況下，Ca2+對(duì)細(xì)胞膜通透性影響較小。

結(jié)果表明Ca2+在低pH脅迫條件下能明顯增加細(xì)胞膜的通透性，而細(xì)胞膜通透性的增加有助于胞內(nèi)外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的互換，克服胞內(nèi)產(chǎn)物的抑制作用，從而增強(qiáng)酵母的代謝。

圖9 相同pH、不同Ca2+濃度下對(duì)還原糖利用的影響

圖10 pH和Ca2+對(duì)糖代謝的影響

2.6 pH和Ca2+對(duì)酵母細(xì)胞膜完整性的作用

當(dāng)細(xì)胞膜完好無(wú)損時(shí)，PI不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，此時(shí)主要是FDA與細(xì)胞內(nèi)的脂酶相結(jié)合產(chǎn)生熒光素，在熒光顯微鏡下產(chǎn)生綠色熒光信號(hào)。細(xì)胞膜受損之后PI染料大分子物質(zhì)才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞內(nèi)的核酸物質(zhì)（DNA和RNA）相結(jié)合，熒光的顏色向紅色轉(zhuǎn)變，使得死亡細(xì)胞發(fā)出紅色熒光。由圖12可知，相同Ca2+濃度下，相比于pH為5.5，pH為3.0的發(fā)酵體系中綠色細(xì)胞比率較低，根據(jù)顯色原理說(shuō)明低pH值破壞酵母細(xì)胞膜的完整性，造成細(xì)胞死亡。而且當(dāng)Ca2+的濃度越低，pH為3.0的發(fā)酵體系中綠色細(xì)胞比率降低越明顯。

圖11 不同發(fā)酵體系發(fā)酵液的電導(dǎo)率

在同一pH條件下，隨著Ca2+濃度的增大，熒光顯微鏡下綠色細(xì)胞的比率越來(lái)越大，即活細(xì)胞所占的比率越來(lái)越大，說(shuō)明細(xì)胞膜的完整性越來(lái)越好。但在pH3.0的發(fā)酵體系中，Ca2+的影響更加明顯。

由實(shí)驗(yàn)分析可得Ca2+和pH對(duì)酵母細(xì)胞代謝影響和對(duì)細(xì)胞膜的影響作用相同，表明Ca2+可以提高細(xì)胞膜的通透性和維持對(duì)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，這與緩解pH的毒害作用密切相關(guān)。

3 討論

前人研究表明培養(yǎng)基pH和K+的相互作用是影響發(fā)酵進(jìn)程的一個(gè)關(guān)鍵因素。當(dāng)發(fā)酵液中pH值和K+的含量均很低時(shí)，會(huì)造成發(fā)酵不徹底；而且只有在pH較低的條件下，K+的促進(jìn)作用才會(huì)表現(xiàn)出來(lái)［24-25］。本文在此基礎(chǔ)上對(duì)Ca2+和pH的相互作用進(jìn)行了相關(guān)的研究，結(jié)果證明了Ca2+和K+具有相似的作用，只有當(dāng)pH較低時(shí)，Ca2+才對(duì)酵母代謝表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用。

圖12 pH和Ca2+的協(xié)同作用下對(duì)酵母細(xì)胞完整性的影響

周風(fēng)帆等［26］的研究結(jié)果表明鈣離子的加人能提高低pH下水蚤的存活率［27］；孔繁翔等［28］的研究也表明當(dāng)培養(yǎng)基中加入適當(dāng)量的Ca2+，會(huì)一定程度保護(hù)藻細(xì)胞中酸性磷酸酶和硝酸還原酶活性不受低pH的影響。前人的其他研究結(jié)果與本研究結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證明Ca2+能緩解低pH帶來(lái)的生理毒害作用，且只有在低pH下Ca2+才表現(xiàn)出作用。而在酵母菌的最適pH下Ca2+并沒(méi)有發(fā)揮大的作用。同時(shí)，本研究深入了解了酵母細(xì)胞的脅迫應(yīng)答機(jī)制，通過(guò)添加適當(dāng)濃度的Ca2+，更好的解決在葡萄酒發(fā)酵初期低pH對(duì)酵母細(xì)胞的毒害作用；也不會(huì)影響酵母細(xì)胞對(duì)其他重要離子的吸收，更好地控制酵母細(xì)胞的酒精發(fā)酵進(jìn)程［29］。酒精發(fā)酵作為葡萄酒釀造的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，延遲和停滯（非理想狀態(tài)發(fā)酵）現(xiàn)象一直是葡萄酒釀造領(lǐng)域普遍關(guān)注的問(wèn)題［30］。在本研究基礎(chǔ)上可以通過(guò)調(diào)控pH值和Ca2+的含量比例來(lái)優(yōu)化發(fā)酵進(jìn)程。

由于本研究所采用的培養(yǎng)基是模擬葡萄汁培養(yǎng)基，與實(shí)際釀造葡萄酒時(shí)的葡萄汁有一定的差別，故在實(shí)際生產(chǎn)中可能會(huì)出現(xiàn)偏差，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整和改善，以期達(dá)到最優(yōu)結(jié)果。

4 結(jié)論

本文研究了pH和Ca2+協(xié)同作用對(duì)酵母代謝的影響，結(jié)果表明只有當(dāng)pH較低時(shí)，Ca2+才對(duì)酵母代謝表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用。低pH時(shí)添加Ca2+能顯增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，有助于胞外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入胞內(nèi)促進(jìn)酵母細(xì)胞的生理活性及生長(zhǎng)代謝；以及有助于胞內(nèi)代謝產(chǎn)物分泌到胞外，克服胞內(nèi)產(chǎn)物的抑制作用。另外，Ca2+增強(qiáng)細(xì)胞膜的完整性有助于減輕外界環(huán)境對(duì)酵母細(xì)胞的抑制甚至毒害作用。由此從細(xì)胞膜的角度解釋Ca2+緩解pH生理毒害，促進(jìn)酵母代謝的機(jī)制。

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