姜思源 丑天勝 李肖 黃蓉梅 謝寶貴

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福州 350002；2. 中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100080）

金針菇（Flammulina velutipes）又被稱為金錢菇、小火菇，是目前食用菌消費市場上常見的品種之一，其農(nóng)藝性狀具有菌柄細長，菌蓋小的特點［1］。金針菇子實體富含各類氨基酸，其中尤以精氨酸含量顯著高于其他食用菌［2］。此外，在金針菇的子實體中，菌柄部位為主要供食用的部分。因此在實際生產(chǎn)實踐中，菌柄長度往往決定了金針菇商品性狀優(yōu)良與否。目前在子實體菌柄伸長機制的研究中依然以傳統(tǒng)的研究方式居多，但隨著金針菇基因組破譯和不斷豐富的分子生物學(xué)操作技術(shù)，為揭示金針菇子實體菌柄伸長發(fā)育的分子機理研究提供數(shù)據(jù)支撐［3］。

腺苷酸合成酶系（Adenylate-forming enzymes）是一類廣泛分布在生物界當(dāng)中的一種酶系，其在原核與真核生物的脂肪酸代謝、能量代謝等生理生化過程中扮演了重要角色［4］。腺苷酸合成酶的作用機制在ATP、Mg2+等輔因子的幫助下催化弱親核性的羧酸基團與弱親電性的磷酸基團間的聚合反應(yīng)［5-6］。根據(jù)結(jié)構(gòu)特點，該酶系分為3大家族，分別為 ClassI、ClassII和 ClassIII。其中，ClassI又分為3個亞族，分別為ClassIa：NRPS（Adenylation domains of nonribosomal peptide synthetases） 家 族、ClassIb：乙酰輔酶A合成酶和脂酰輔酶A合成酶家族、ClassIc：熒光素酶家族［7-9］。有研究發(fā)現(xiàn)，腺苷酸合成酶系中熒光素酶能夠催化分子氧氧化熒光素而發(fā)光的過程，其作用的實質(zhì)是該酶能夠在ATP、Mg2+輔因子的幫助下催化脂肪酸生成脂酰輔酶A，從而催化該反應(yīng)的進行［10］。另外，該酶系在生物體內(nèi)各不同的生物過程中也起到了重要作用，如蛋白質(zhì)合成、DNA合成及次生代謝產(chǎn)物合成等［11-18］。

本研究以本實驗室前期篩選得到金針菇編碼腺苷酸合成酶基因Fv-Afe1作為對象基因，結(jié)合生物信息學(xué)、RNAseq等實驗技術(shù)手段，分析了Fv-Afe1基因及其產(chǎn)物的基本結(jié)構(gòu)，并通過熒光定量手段探究其在金針菇子實體菌柄伸長及在子實體發(fā)育過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

金針菇雙核菌株FL19和金針菇單核菌株L11，均由福建省食用菌種質(zhì)資源保藏與管理中心提供。

1.2 方法

1.2.1 樣品收集 金針菇雙核菌株FL19出菇參照呂作舟等的方法［19］，采集菌絲并在出菇后采集子實體原基、伸長期菌柄、伸長期菌蓋、成熟期菌柄和成熟期菌蓋存放于-80℃，用于RNA的提取。

1.2.2 參考基因組和轉(zhuǎn)錄組 金針菇單核菌株L11基因組數(shù)據(jù)和雙核菌株H1123轉(zhuǎn)錄組及表達譜數(shù)據(jù)均由福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心提供，L11基因組登錄號為 APIA00000000（BioProject：191865）。L11基因組數(shù)據(jù)及H1123轉(zhuǎn)錄組均由深圳華大基因研究院進行測序。

1.2.3 RNA的提取及第一鏈cDNA的合成 采用OMEGA E.Z.N.A.Plant RNA Kit（R6827-01）試劑盒（Omega Bio-Tek，美國）提取雙核菌絲體總RNA，然后使用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Sythesis Super Mix for qPCR試劑盒（全式金生物技術(shù)有限公司，北京）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，操作參照試劑盒說明書。

1.2.4Fv-Afe1基因的確定及生物信息學(xué)分析 將金針菇H1123的子實體原基、伸長期菌柄、伸長期菌蓋、成熟期菌柄和成熟期菌蓋的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行篩選、分析并獲取基因編號，以L11基因組數(shù)據(jù)、H1123轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為參考，獲取基因DNA和氨基酸序列。采用SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）進行蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測與分析；采用TargetP程 序（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP）對蛋白質(zhì)亞細胞進行定位分析；使用TMHMM Server v. 2.0在線跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對金針菇類信息素受體家族蛋白進行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測。

采 用Phyre2程 序（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2）分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)；將驗證后的Fv-Afe1序列提交到EBI的Interpro數(shù)據(jù)庫上預(yù)測分析其保守結(jié)構(gòu)域；并從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載部分腺苷酸合成酶氨基酸序列，應(yīng)用MEGA6.0軟件采用鄰位相連法（Neighbor-Joining）進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，Bootstrap value設(shè)為1 000［20］。參照嚴俊杰等［21］的方法，以Fv-Afe1基因序列分別向兩側(cè)延長1.5 kb 作為參考序列，采用 ZOOM軟件將轉(zhuǎn)錄組測序讀段定位至參考序列上［22］，參數(shù)設(shè)置為雙末端模式，允許堿基錯配數(shù)設(shè)置為38 bp。對定位結(jié)果進行分析，確定基因內(nèi)含子、外顯子。

1.2.5Fv-Afe1基因表達量分析 以Fv-Afe1全長基因序列為參照序列（Reference sequence），通過ZOOM軟件將金針菇6個生長時期的表達標(biāo)簽庫（Tag library）進行定位（Mapping），統(tǒng)計在Fv-Afe1基因上具有唯一定位的標(biāo)簽種類及其數(shù)量并且進行標(biāo)準化處理，最終數(shù)據(jù)輸出用TPM（Transcript per million clean tags）表示。

TransStart TOP Green qPCR（全式金生物技術(shù)有限公司，北京）作為實時熒光定量PCR（qRTPCR）的定量試劑，使用CFX96實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國）進行PCR反應(yīng)，采用Primer Premier 5 進行實時熒光定量PCR引物設(shè)計，以GAPDH基因作為內(nèi)參基因進行表達量檢測，引物序列見表1。反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參照實時熒光定量PCR試劑盒說明書。相對表達量采用2-△△Ct法處理。

表1 熒光實時定量PCR所使用的引物

2 結(jié)果

2.1 Fv-Afe1基因結(jié)構(gòu)

Fv-Afe1在金針菇L11基因組中的ID號為gene9981，通過Blastp的結(jié)果顯示該基因含有腺苷酸合成酶的保守結(jié)構(gòu)域，屬于腺苷酸合成酶超家族成員基因，將其命名為Fv-Afe1?；蛉L為967bp，通過轉(zhuǎn)錄組reads定位獲得該基因的轉(zhuǎn)錄本全長為795 bp，含有4個外顯子，3個內(nèi)含子（圖1）。

圖1 Fv-Afe1基因的結(jié)構(gòu)

2.2 Fv-Afe1基因蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

將Fv-Afe1的氨基酸序列提交到EBI蛋白數(shù)據(jù)庫中進行結(jié)構(gòu)域分析，InterPro結(jié)果顯示金針菇Fv-Afe1氨基酸序列含有AMP-dependent synthetase/ligase（IPR000873）結(jié)構(gòu)域和 AMP-binding enzyme，C-terminal domain（IPR025110）結(jié)構(gòu)域，這兩個結(jié)構(gòu)域與腺苷酸合成酶氨基酸的典型結(jié)構(gòu)域保持一致，用Phyre2在線預(yù)測Fv-Afe1三級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)v-Afe1三級結(jié)構(gòu)被分為兩個Domain，它們之間由鉸鏈結(jié)構(gòu)（Hinge）連接，F(xiàn)v-Afe1的N端Domain結(jié)構(gòu)包括α螺旋，β桶（圖2）。從Interpro分析結(jié)果和Phyre2蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，F(xiàn)v-Afe1從蛋白結(jié)構(gòu)上來看具有腺苷酸合成酶的催化活性。對該氨基酸序列進行跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽和亞細胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示，F(xiàn)v-Afe1基因產(chǎn)物不具備跨膜位點，無信號肽存在，亞細胞定位顯示其定位于胞內(nèi)，說明該蛋白屬于胞內(nèi)酶，作用于細胞內(nèi)。

圖2 Fv-Afe1蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)圖

2.3 Fv-Afe1基因系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI下載部分已明確作用、且結(jié)構(gòu)典型的腺苷酸合成酶家族氨基酸序列與Fv-Afe1進行系統(tǒng)發(fā)育分析（圖3）。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看到，F(xiàn)v-Afe1與真菌腺苷酸酶基因聚在一支，其他兩支分別為以源氏螢（Luciola cruciata）為代表熒光素酶家族和以肺炎雙球菌（Streptococcus pneumoniae）為代表的腺苷酸激酶家族。通過Fv-Afe1基因與糙皮側(cè)耳（Pleurotus osteatus）、雙色蠟?zāi)ⅲ↙accaria bicolor）、紫蠟?zāi)ⅲ↙accaria amethystina）和云芝（Trametes versicolor）的腺苷酸合成酶基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示它們之間的同源性極高，置信度達到100%。

2.4 Fv-Afe1的差異表達分析

金針菇的轉(zhuǎn)錄組和表達譜數(shù)據(jù)分析中可以得出Fv-Afe1基因在各個時期均表達，其中在伸長期菌柄表達量顯著高于其它時期，該基因在金針菇各個發(fā)育時期不同部位的熒光定量結(jié)果也符合這一規(guī)律（圖4），說明這一基因可能與金針菇菌柄伸長有較為密切的關(guān)系。

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)金針菇的菌蓋和菌柄的交界處下1-2 mm 處是伸長的主要區(qū)域［23］。另外，有發(fā)現(xiàn)認為在真菌中菌柄的伸長生長是通過吸收水分以及細胞的表面積擴張實現(xiàn)的，細胞壁的松弛也使得新的物質(zhì)摻入從而適應(yīng)細胞的伸長［24］。也有研究發(fā)現(xiàn)一些酶系和轉(zhuǎn)錄因子對細胞形態(tài)建成的變化具有作用［25］。因此，菌柄伸長機制是一個復(fù)雜的過程，涉及到多種酶系的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［26］。本研究基于基因組數(shù)據(jù)，在金針菇中鑒定獲得一個腺苷酸合成酶基因并對其基因結(jié)構(gòu)及不同發(fā)育時期的表達模式進行了詳細的分析，這對于其他擔(dān)子菌的相關(guān)研究具有一定的參考價值。

圖3 Fv-Afe1系統(tǒng)進化分析

圖4 Fv-Afe1基因在金針菇的6個時期的表達譜及qRTPCR的表達分析

有研究認為金針菇菌柄伸長是受到菌褶中激素的調(diào)控，類似于植物中關(guān)于生長素的“酸生長學(xué)說”［27］。該研究認為生長素通過結(jié)合并活化存在于質(zhì)膜上質(zhì)子泵（H+-ATP 酶），轉(zhuǎn)運細胞內(nèi)的氫離子到細胞壁上，降低pH值，使基質(zhì)環(huán)境處于酸性，進而細胞壁中的一些氫鍵斷裂，同時活化了細胞壁上的多糖水解酶，催化斷裂纖維素微纖絲和葡聚糖之間連接的鍵，最終致使細胞壁變得松弛。

腺苷酸合成酶超家族廣泛存在于生物中，該家族涉及生化過程中重要的中間代謝物脂酰輔酶A和乙酰輔酶A的合成與分解，使得該家族基因能夠參與到蛋白質(zhì)合成、脂質(zhì)分解代謝及能量代謝等生化過程中［28-29］。而科研人員在肺炎雙球菌（Streptococcus pneumoniae）中發(fā)現(xiàn)，腺苷酸激酶的表達與其生長速率存在關(guān)聯(lián)，作用機制是通過增加ATP在機體的含量從而影響肺炎雙球菌的生長［30］。本研究通過轉(zhuǎn)錄組和表達譜數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)v-Afe1在金針菇伸長菌柄時期具有最高表達，在成熟期菌柄具有次高表達，這說明該基因可能參與到了菌柄形態(tài)建成的基因調(diào)控，特別是對于菌柄的伸長過程可能起到了重要作用。但是關(guān)于該基因具體以何種方式參與到金針菇菌柄伸長過程，以及該基因位于基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)何種位置還需更加深入的研究。

4 結(jié)論

氨基酸三級結(jié)構(gòu)預(yù)測、生物信息學(xué)分析及系統(tǒng)發(fā)育顯示Fv-Afe1屬于腺苷酸合成酶超家族成員，熒光定量實驗和轉(zhuǎn)錄組表達譜分析顯示該基因在菌柄伸長期菌柄部位具有最高表達，成熟期菌柄具有次高表達，這說明該基因與菌柄伸長機制有關(guān)。

［1］ 畢志樹, 鄭國揚, 李泰輝. 廣東大型真菌志［M］. 廣州：廣東科技出版社, 1994.

［2］ 魏華, 謝俊杰. 金針菇營養(yǎng)保健作用［J］. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),1997, 9（2）：92-97.

［3］ Lu YP, Chen RL, Long Y, et al. A jacalin-related lectin regulated the formation of aerial mycelium and fruiting body inFlammulina velutipes［J］. Int J Mol Sci, 2016, 17（12）：1884.

［4］Zhang Z, Zhou R, Sauder JM, et al. Structural and functional studies of fatty Acyl adenylate ligases fromE. coliandL. pneumophila［J］.J Mol Biol, 2011, 406：313-324.

［5］Bronstein I, Fortin J, Stanley PE, et al. Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays［J］. Anal Biochem, 1994,219：169-181.

［6］Greer LF III, Szalay AA. Imaging of light emission from the expression of luciferases in living cells and organisms：a review［J］. Luminescence, 2002, 17：43-73.

［7］Schmelz S, Naismith JH. Adenylate-forming enzymes［J］. Current Opinion in Structural Biology, 2009, 19：666-671.

［8］Wu R, Reger AS, Lu X, et al. The mechanism of domain alternation in the acyl-adenylate forming ligase superfamily member 4-chlorobenzoate：coenzyme A ligase［J］. Biochemistry, 2009,48：4115-4125.

［9］Weimer KM, Shane BL, Brunetto M, et al. Evolutionary basis for the coupled-domain motions inThermus thermophilusleucyl-tRNA synthetase［J］. J Biol Chem, 2009, 284（15）：10088-10099.

［10］ Perona JJ, Hou YM. Indirect readout of tRNA for aminoacylation［J］. Biochemistry, 2007, 46：10419-10432.

［11］Inouye S. Firefly luciferase：an adenylate-forming enzyme for multicatalytic functions［J］. Cell Mol Life Sci, 2010, 67 ：387-404.

［12］Schulman BA, Harper JW. Ubiquitin-like protein activation by E1 enzymes：the apex for downstream signalling pathways［J］. Nat Rev Mol Cell Biol, 2009, 10：319-331.

［13］Shuman S. DNA ligases：progress and prospects［J］. J Biol Chem, 2009, 284：17365-17369.

［14］Chapman-Smith A, Cronan JJE. The enzymatic biotinylation of proteins：a post-translational modification of exceptional specificity［J］. Trends Biochem Sci, 1999, 24：359-363.

［15］Chen L, Petrelli R, Felczak K, et al. Pankiewicz, Nicotinamide adenine dinucleotide based therapeutics［J］. Curr Med Chem,2008, 15：650-670.

［16］Watkins PA. Fatty acid activation, Prog［J］. Lipid Res, 1997,36：55-83.

［17］Sieber SA, Marahiel MA. Molecular mechanisms underlying nonribosomal peptide synthesis：approaches to new antibiotics［J］. Chem Rev, 2005, 105：715-738.

［18］Gulick AM. Conformational dynamics in the acyl-CoA synthetases.Adenylation domains of non-ribosomal peptide synthetases, and firefly luciferase［J］. ACS Chem Biol, 2009, 4：811-827.

［19］呂作舟, 張引芳, 等. 食用菌關(guān)鍵技術(shù)問答：金針菇 真姬菇杏鮑菇 楊樹菇［M］. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社, 2010：42-64.

［20］Tamura K, Stecher G, Peterson D, et al. MEGA6：molecular evolutionary genetics analysis version 6. 0［J］. Molecular Biology and Evolution, 2013, 30（12）：2725-2729.

［21］嚴俊杰, 郭麗羨, 趙靜靜, 等. 草菇谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶編碼基因（vv-gto1）的序列分析及其差異表達［J］. 微生物學(xué)報,2014, 10：1171-1177.

［22］Zhang ZF, Lin H, Ma B. ZOOM Lite：next-generation sequencing data mapping and visualization software［J］. Nucleic Acids Research, 2010, 38：743-748.

［23］李繼影. 毛柄金線菌子實體菌柄細胞壁伸長生長的研究［D］.南京：南京師范大學(xué), 2005.

［24］Jacobson K, Mouritsen OG, Anderson RGW. Lipid rafts：at a crossroad between cell biology and physics［J］. Nat Cell Biol,2007, 9（1）：7-14.

［25］Guan XL, Souza CM, Pichler H, et al. Functional interactions between sphingolipids and sterols in biological membranes regulating cell physiology［J］. Mol Biol Cell, 2009, 20（7）：2083-2095.

［26］Tyler KM, Fridberg A, Toriello KM, et al. Flagellar membrane localization via association with lipid rafts［J］. J Cell Sci, 2009,122（6）：859-866.

［27］Lingwood D, Kai S. Lipid rafts as a membrane-organizing principle［J］. Science, 2010, 327（5961）：46-51.

［28］Rayle DL, Cleland R. Enhancement of wall loosening and elongation by acid solutions［J］. Plant Physiol, 1970, 46（2）：250-253.

［29］Robertson NF. Experimental control of hyphal branching and branch form in hyphomycetous fungi［J］. Journal of the Linnean Society of London, Botany, 1959, 56（366）：207-211.

［30］Thach TT, Luong TT, Lee S, et al. Adenylate kinase fromStreptococcus pneumoniaeis essential for growth through its catalytic activity［J］. FEBS Open Bio, 2014, 4 ：672-682.