李成名 王佳懿 盧磊

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040）

漆 酶（EC 1.10.3.2，p-diphenol：dioxygen oxidoreductase）是一種多銅氧化還原酶，銅中心催化底物的單電子氧化過(guò)程，將電子轉(zhuǎn)移到分子氧并生成水，氧化底物產(chǎn)生的自由基可以進(jìn)行非酶反應(yīng)，包括單體交聯(lián)、聚合物的降解和芳香化合物的環(huán)裂，具有催化底物的廣譜性［1］。近些年來(lái)的研究表明漆酶在造紙工業(yè)、食品工業(yè)、紡織工業(yè)、有機(jī)合成和污染物降解等領(lǐng)域具有廣泛用途［2］。

一般真菌漆酶在酸性條件下（pH 4-6）和30-55℃下保持較高的活性［3］，而造紙和紡織等工業(yè)領(lǐng)域往往伴隨著高溫、強(qiáng)堿等反應(yīng)條件，使真菌漆酶的應(yīng)用受到限制且使用成本較高。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的證據(jù)表明漆酶廣泛分布在細(xì)菌中，研究較深入的是枯草芽孢桿菌的芽孢外壁蛋白CotA，該漆酶具有較高的熱穩(wěn)定性，在80℃的半衰期高達(dá)2 h［4］。由于芽孢特殊構(gòu)造，CotA蛋白與芽孢內(nèi)壁其他蛋白緊密相連［5］，不易分離純化，在一定程度上限制了其應(yīng)用。重組表達(dá)是克服這一障礙的有效方法［6-7］。畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)在進(jìn)行外源基因表達(dá)時(shí)，具有生長(zhǎng)周期短、可進(jìn)行胞外分泌表達(dá)、目的蛋白易于純化和易于高密度發(fā)酵培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)［8］。

實(shí)驗(yàn)室前期從森林土壤中篩選分離到一株具有較高漆酶活性的短小芽孢桿菌LC01，本研究通過(guò)克隆出短小芽孢桿菌的漆酶基因，并在畢赤酵母中進(jìn)行高活性分泌表達(dá)，同時(shí)研究重組漆酶的酶學(xué)性質(zhì)以及對(duì)染料的脫色能力，旨在為推動(dòng)細(xì)菌漆酶在染料廢水處理中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）LC01保存于東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。大腸桿菌（Escherichia coli）TOP10為北京天根公司產(chǎn)品；表達(dá)載體pPICZαA和畢赤酵母（Pichia pastoris）SMD1168H購(gòu)自Invitrogen公司。

1.1.2 酶和主要試劑 2，2'-連氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）、丁香醛連氮（Syringaldazine，SGZ）、2，6-二 甲 氧 基 苯 酚（2，6-dimethoxyphenol，DMP）、乙酰丁香酮、RB亮藍(lán)、活性黑5和靛紅為Sigma公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒為Omega公司產(chǎn)品；Q5高保真聚合酶，EcoR I、SacII和SacI限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶為NEB公司產(chǎn)品，dNTP，低分子量蛋白marker為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；Zeocin為Invitrogen公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基 LLB、YPD、BMGY、BMM等培養(yǎng)基配方和畢赤酵母SMD1168H培養(yǎng)條件參照Invitrogen公司提供的畢赤酵母操作手冊(cè)。

1.2 方法

1.2.1 漆酶基因的PCR擴(kuò)增 采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取短小芽孢桿菌LC01的基因組DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增漆酶基因，PCR擴(kuò)增引物為：上游引物5'-CGGGAATTCAACCTAGAAAAATTTGTTGACG AGC-3'；下游引物5'-TCCCCGCGGTTACTGGATGA TATCCATCGGC-3'。PCR擴(kuò)增條件為：98℃，30 s；98℃，8 s；54℃，30 s；72℃，50 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃，2 min。

1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pPICZαA經(jīng)EcoR I和SacII雙酶切后膠回收純化，然后用T4 DNA連接酶4℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，在含Zeocin（25 mg/L）的LLB平板上篩選陽(yáng)性克隆。對(duì)陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)一步進(jìn)行酶切驗(yàn)證，并送到上海Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 畢赤酵母的轉(zhuǎn)化與篩選 構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pPICZαA-lac經(jīng)SacI線性化后，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)化條件為1 500 V，5 ms。將YPD/Zeocin抗性平板上的重組菌株點(diǎn)接至添加0.2 mmol/L CuSO4和0.1 mmol/L ABTS的BMM篩選培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)。每隔24 h定時(shí)向培養(yǎng)皿蓋中補(bǔ)加甲醇（100 μL），直至菌落周圍出現(xiàn)綠色反應(yīng)圈，根據(jù)反應(yīng)圈顏色的深淺篩選高效重組菌株。將高活性的重組菌株轉(zhuǎn)接到BMGY液體培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min 培養(yǎng)至OD600為2.0-6.0，3 000×g離心5 min后將菌體沉淀用BMM液體培養(yǎng)基稀釋菌至OD600為1.0，30℃，200 r/min 培養(yǎng)，每隔24 h定時(shí)向培養(yǎng)基中加入終濃度0.5%（V/V）甲醇誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)并繪制培養(yǎng)曲線。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3個(gè)平行。

1.2.4 重組漆酶純化 依據(jù)產(chǎn)酶曲線，在重組蛋白表達(dá)量最高時(shí)收集培養(yǎng)液，離心收集上清液移到透析袋中，利用PEG20000進(jìn)一步濃縮。采用DEAESepharose FF對(duì)濃縮的漆酶樣品進(jìn)行離子交換層析，緩沖液為20 mmol/LTris-HCl緩沖液（pH 7.5），使用濃度為0-1 mol/L的NaCl進(jìn)行梯度洗脫，收集具有漆酶活性的組分并進(jìn)行超濾濃縮。然后采用Sephadex G75進(jìn)行凝膠層析，用20 mmol/L pH 7.5的磷酸鹽緩沖液洗脫，收集有活性組分，采用SDSPAGE檢測(cè)純化后的蛋白條帶。

1.2.5 漆酶活性的測(cè)定 分別采用ABTS、SGZ和DMP為底物檢測(cè)漆酶活性［9］。采用ABTS為底物時(shí)，3 mL反應(yīng)體系含一定體積的漆酶樣品，0.1 mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液和1 mmol/L的ABTS，30℃反應(yīng)3 min后在420 nm處測(cè)定吸光值。采用SGZ為底物時(shí)，3 mL反應(yīng)體系含一定體積的漆酶樣品，0.1 mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液，0.1 mmol/L的SGZ，30℃反應(yīng)3 min后在525 nm處測(cè)定吸光值。采用DMP為底物時(shí)，3 mL反應(yīng)體系含一定體積的漆酶樣品，0.1 mmol/L的Tris-HCl緩沖液和1 mmol/L的DMP，30℃反應(yīng)3 min后在468 nm處測(cè)定吸光值。以1 min內(nèi)催化氧化1 μmol底物所需的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。所有測(cè)定均重復(fù)3次取平均值。

1.2.6 漆酶酶學(xué)性質(zhì)

1.2.6.1 pH對(duì)漆酶活性及穩(wěn)定性的影響 采用不同pH的0.1 mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH 2.2-7.0），0.1 mol/L Tris-HCl緩 沖 液（pH 7.0-9.0），0.1 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH范圍為9.0-10.0）。以ABTS、SGZ和DMP為底物測(cè)定漆酶活性，確定漆酶的最適反應(yīng)pH。pH穩(wěn)定性的研究通過(guò)將漆酶在30℃時(shí)將漆酶與不同的緩沖液混合放置1-10 d后測(cè)定漆酶殘余活性。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6.2 溫度及穩(wěn)定性的影響 在最適pH下，以SGZ為底物分別在20-100℃條件下檢測(cè)酶活，確定重組漆酶的最適反應(yīng)溫度。將漆酶樣品在50、60、70和80℃保溫0-10 h后測(cè)定漆酶活性，研究重組漆酶在不同溫度下的熱穩(wěn)定性。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6.3 動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定 以不同濃度的ABTS、SGZ和DMP為底物，分別在最適pH、30℃下測(cè)定重組漆酶的酶活，利用Lineweaver-Burk法，求出kcat和Km值。所有測(cè)定均重復(fù)3次取平均值。

1.2.6.4 抑制劑及有機(jī)溶劑對(duì)重組漆酶活性的影響 將漆酶常見(jiàn)的抑制劑（半胱氨酸、SDS、EDTA和NaN3）和有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇、丙酮和乙腈）與重組漆酶混合均勻后在30℃條件下以SGZ為底物測(cè)定漆酶剩余活性。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。選取常見(jiàn)的金屬離子并使其終濃度為10 mmol/L，在30℃時(shí)加入底物SGZ反應(yīng)3 min測(cè)定酶活。

1.2.6.5 金屬離子對(duì)重組漆酶活性的影響 配制終濃度為10 mmol/L的金屬離子Ba2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、Al3+、K+、Na+、Co2+，并設(shè)置陰性對(duì)照，30℃下以SGZ為底物測(cè)定剩余酶活。所有測(cè)定均重復(fù)3次。

1.2.6.6 重組漆酶的染料脫色 選擇RB亮藍(lán)（λmax=591 nm）、活性黑5（λmax=597 nm）和靛紅（λmax=610 nm）染料進(jìn)行在介體乙酰丁香酮參與下進(jìn)行染料脫色研究。6 mL脫色體系包括緩沖液、染料（終濃度分別為100、40、25 mg/L），0.1 mmol/L乙酰丁香酮，重組漆酶（終濃度為20 U/L），在相同條件下以不加酶液為空白對(duì)照。脫色過(guò)程在pH 6.8和9.0，40℃進(jìn)行。

脫色率用染料在最大吸收峰下其吸光值減少的百分比表示。計(jì)算公式為：脫色率（%）=（A0-A）/A0×100%，A0為初始染料吸光值，A為反應(yīng)一段時(shí)間后測(cè)的吸光值。所有測(cè)定均重復(fù)3次取平均值。

2 結(jié)果

2.1 漆酶基因的克隆

以短小芽孢桿菌LC01的基因組為模板擴(kuò)增漆酶基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)大小約為1.5 kb，與預(yù)期大小相符。測(cè)序結(jié)果分析表明該漆酶基因全長(zhǎng)為1 533 bp（GenBank登錄號(hào)KC237769），編碼510個(gè)氨基酸。將菌株LC01的漆酶基因序列在NCBI上進(jìn)行BLAST分析，選擇相似度較高的細(xì)菌漆酶采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果（圖1）表明LC01與其他芽孢桿菌的CotA漆酶基因序列具有較高的同源性，與Bacillus pumilusW3 cotA（KF040050）和B. altitudinisSYBC hb4 cotA（KU363621）的同源性達(dá)到了97%，與B. pumilusMK001的cotA（JQ734990）的同源性達(dá)到了88%。

2.2 重組漆酶的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

通過(guò)每天定時(shí)加入定量的甲醇誘導(dǎo)AOX1調(diào)控重組基因的表達(dá)，產(chǎn)酶曲線（圖2）表明，前4 d緩慢升高，在第4天開(kāi)始快速上升，在第7天達(dá)到峰值，為1 390±58 U/L。利用離子交換層析和凝膠層析對(duì)收集的粗酶液進(jìn)行純化，純化后漆酶的SDS-PAGE電泳呈現(xiàn)單一條帶，無(wú)其他雜蛋白（圖3），表明重組漆酶純化效果較好。該重組漆酶大小約為65 kD。

圖1 基于漆酶基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 pH對(duì)漆酶活性及穩(wěn)定性的影響

以ABTS、SGZ和DMP為底物時(shí)的最適pH分別為3.0、6.8和7.4（圖4-A）。重組漆酶的pH穩(wěn)定性結(jié)果如圖4-B，在酸性條件下的穩(wěn)定性較差，5 d后喪失了80%的酶活。而在中性和堿性條件下穩(wěn)定性較好，尤其是pH 9.0條件下保存10 d后，較初始酶活基本沒(méi)有損失。這表明該細(xì)菌重組漆酶的pH反應(yīng)條件寬泛，在不同的pH范圍內(nèi)仍可以保持穩(wěn)定的催化活性。

圖2 畢赤酵母表達(dá)重組漆酶的產(chǎn)酶曲線

2.4 溫度對(duì)漆酶活性及穩(wěn)定性的影響

重組漆酶的最適溫度為70℃，在50-80℃保持較高的催化活性（圖5-A）。溫度穩(wěn)定性如圖5-B所示，在50℃下溫浴10 h后基本保持其較高的催化活性，60℃放置10 h后保持初始酶活的48%，隨著溫浴時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度的提高，重組漆酶的催化活性顯著下降，在70℃、10 h后保留初始酶活的36%，80℃放置6 h后剩余19%的酶活。

圖3 純化漆酶的SDS-PAGE檢測(cè)

2.5 重組漆酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)

以ABTS、SGZ、DMP為底物進(jìn)行動(dòng)力學(xué)參數(shù)研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1，SGZ的Km值最低，DMP最高，表明重組漆酶對(duì)SGZ的親和力高于ABTS和DMP。DMP的kcat/Km值最低，表明其催化效率最低，SGZ的催化效率最高，且是ABTS的3倍。

2.6 抑制劑及有機(jī)溶劑對(duì)漆酶活性的影響

低濃度的SDS和EDTA對(duì)酶活有一定的促進(jìn)作用（表2），隨著抑制劑濃度的升高，漆酶催化活性受到了不同程度的抑制作用。在1 mmol/L的SDS和50 mmol/L的EDTA中漆酶可分別保留87%和67%的酶活。半胱氨酸對(duì)漆酶活性的抑制作用最為明顯，在0.1 mmol/L時(shí)即可抑制80%左右的漆酶活性。NaN3對(duì)漆酶活性也有較強(qiáng)的抑制作用，1 mmol/L的NaN3可抑制86%以上的漆酶活性。

圖4 pH對(duì)重組漆酶活性（A）及穩(wěn)定性（B）的影響

圖5 溫度對(duì)漆酶活性（A）及溫度穩(wěn)定性（B）的影響

表1 重組漆酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)

表2 抑制劑對(duì)重組漆酶活性的影響

常見(jiàn)的有機(jī)溶劑對(duì)重組漆酶催化活性的影響如表3，有機(jī)溶劑濃度在10%時(shí)漆酶可保持較高的酶活，隨著有機(jī)溶劑濃度增加，漆酶活性逐漸下降。重組漆酶在甲醇中的穩(wěn)定性要高于其他有機(jī)溶劑，在30%的甲醇中仍可保留77%左右的活性。乙腈對(duì)漆酶的抑制作用較大，在30%的濃度下可抑制87%左右的漆酶活性。

表3 有機(jī)溶劑對(duì)重組漆酶活性的影響

2.7 金屬離子對(duì)漆酶活性的影響

以SGZ為底物，常見(jiàn)金屬離子對(duì)酶活性的影響如圖6，漆酶是一種銅依賴性蛋白，銅離子的加入對(duì)活性影響不大。Co2+、Na+、Mg2+和Ca2+對(duì)重組漆酶酶活有輕微的促進(jìn)作用，而Al3+、Fe3+和Mn2+則完全抑制了重組漆酶的催化活性。

圖6 金屬離子對(duì)重組漆酶的影響

2.8 重組漆酶的染料脫色

選擇常見(jiàn)的染料RB亮藍(lán)、活性黑5、靛紅在乙酰丁香酮作為氧化還原介體進(jìn)行了重組漆酶染料降解能力的研究。結(jié)果如圖7，重組漆酶能夠在pH 6.8、pH 9.0對(duì)3種染料有效的脫色降解。在pH 6.8，1 h內(nèi)RB亮藍(lán)和活性黑5的脫色過(guò)程比較緩慢（圖7-A），RB亮藍(lán)屬于蒽醌染料，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對(duì)重組漆酶顯示出一定的抗性。2 h后活性黑5脫色率增加了40%，達(dá)到了91%。靛紅脫色效率最高，在1 h內(nèi)就已經(jīng)達(dá)到了97%。堿性條件下脫色率明顯增加，重組漆酶保持較高的催化效率（圖7-B），在6 h內(nèi)RB亮藍(lán)、活性黑5、靛紅脫色率分別達(dá)到了90%、97%和98%。高效的染料降解表明該重組漆酶能夠應(yīng)用于生物處理染料廢水過(guò)程。

圖7 重組漆酶對(duì)不同染料的脫色（A）pH 6.8和（B）pH 9.0

3 討論

細(xì)菌漆酶突出的穩(wěn)定性吸引了越來(lái)越多的關(guān)注，目前研究最多的細(xì)菌漆酶來(lái)自于枯草芽孢桿菌CotA漆酶，關(guān)于短小芽孢桿菌的CotA漆酶較少［10-11］。具有漆酶催化活性的CotA蛋白是組成芽孢外壁重要成分之一，尤其是在極端的溫度和pH條件下，依然能夠保持穩(wěn)定的酶學(xué)特性且在異源表達(dá)方面較真菌漆酶更具優(yōu)勢(shì)。如利用大腸桿菌能高密度發(fā)酵培養(yǎng)及遺傳操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)細(xì)菌漆酶的高效重組表達(dá)，從而能有效提高酶活和產(chǎn)量［12］。但大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白一般位于胞內(nèi)［13-16］，需要破碎細(xì)胞進(jìn)行目的蛋白的分離純化，而且細(xì)菌漆酶在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)容易形成大量沒(méi)有活性的包涵體，降低了重組漆酶的表達(dá)量，但畢赤酵母具有生長(zhǎng)速度快，可使用高效的AOX啟動(dòng)子以及可實(shí)現(xiàn)異源蛋白的分泌表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于各種具有工業(yè)用途的重組蛋白的生產(chǎn)［17］。本文通過(guò)克隆短小芽孢桿菌LC01的漆酶基因并在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)胞外表達(dá)，在培養(yǎng)7 d時(shí)培養(yǎng)液上清的漆酶活性達(dá)到1 390 U/L。從表4可看出其重組漆酶的產(chǎn)量，高于其他一些芽孢桿菌如Bacillus subtilisX1在大腸桿菌的表達(dá)量，是同樣以畢赤酵母為表達(dá)系統(tǒng)的B. amyloliquefaciensLC02重組漆酶表達(dá)量的3.7倍［19］。畢赤酵母可通過(guò)高密度發(fā)酵培養(yǎng)大量生產(chǎn)重組蛋白，在提高細(xì)菌漆酶產(chǎn)量的同時(shí)有利于簡(jiǎn)化純化步驟，降低生產(chǎn)成本［20］。

大多數(shù)印染廢水及造紙廢水的pH都在堿性范圍［21］，真菌漆酶一般在酸性條件下保持活性，而在堿性范圍內(nèi)易失活，因此限制了在廢水處理中的作用［22］。菌株LC01的重組漆酶以SGZ和ABTS為底物的最適pH分別為6.8和3.0，這與已報(bào)道的細(xì)菌漆酶如Lactobacillus plantarum、Aquisalibacillus elongatus的漆酶結(jié)果相近［23-24］，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在酸性范圍內(nèi)重組漆酶對(duì)ABTS催化活力較強(qiáng)。在穩(wěn)定性方面，本實(shí)驗(yàn)的重組漆酶在中性和堿性條件下都具有較好的催化活性，在pH 9.0放置10 d后酶活沒(méi)有下降，相比之下，一些細(xì)菌漆酶如耐熱芽孢桿菌SL-1在大腸桿菌表達(dá)的重組漆酶在pH 8.5處理3 d后僅保留17%的初始酶活［25］。與一些pH穩(wěn)定的細(xì)菌相比，如Klebsiella pneumoniae重組漆酶在pH 9.0放置1 d后剩余酶活低于70%［26］；Pleurotus nebrodensis真菌漆酶Lac1在pH 8時(shí)酶活急劇下降［27］。因引，菌株LC01的重組漆酶可以在廣泛的pH下催化底物并在堿性條件下保持穩(wěn)定的酶活性。

表4 不同細(xì)菌漆酶基因表達(dá)結(jié)果比較

溫度是影響漆酶活性的另一重要因素。在溫度穩(wěn)定性方面，該重組漆酶在60-80℃內(nèi)保持較好的催化活性，在70℃的酶活半衰期約為4 h，具有較好的熱穩(wěn)定性。這要高于一些熱穩(wěn)定性真菌漆酶，例如Cladosporium cladosporioides的漆酶在80℃下處理5 min就已經(jīng)失去了52%的酶活［28］，而其他一些真菌漆酶則在溫和的條件下保持較高的催化活性［27］。相比其他細(xì)菌漆酶，如Ricklefs等［29］從Corynebacterium glutamicum中克隆到CgL1，實(shí)驗(yàn)顯示在70℃保溫1 h后喪失了50%酶活，最近報(bào)道的一些具有熱穩(wěn)定性的細(xì)菌Bacillussp. SL-1和B.licheniformisATCC 9945a的重組漆酶在70℃的酶活半衰期分別為 1 h 和 50 min［25，30］，Pawlik 等［31］通過(guò)對(duì)苜蓿根瘤菌漆酶的研究顯示在70℃處理30 min后酶活損失超過(guò)了80%。到目前為止，越來(lái)越多的報(bào)道表明細(xì)菌漆酶具有更高的熱穩(wěn)定性，如B.tequilensis漆酶在70℃放置24 h仍可保留80%的活性［32］。

本實(shí)驗(yàn)選擇常用的偶氮類、蒽醌類和靛族染料進(jìn)行細(xì)菌重組漆酶脫色能力的研究。結(jié)果表明，該重組漆酶在乙酰丁香酮參與下對(duì)三類染料能夠進(jìn)行有效的脫色，使用小分子介體物質(zhì)進(jìn)行電子傳遞從而達(dá)到提高脫色效率［33］。菌株LC01重組漆酶對(duì)靛紅在1 h內(nèi)的脫色率達(dá)到97%，遠(yuǎn)高于一些真菌和細(xì)菌漆酶［34-36］。本文對(duì)RB亮藍(lán)染料4 h內(nèi)的脫色率為72%，而其他細(xì)菌漆酶如Pantoea ananatis的漆酶在4 h的脫色率僅為35%［37-39］，由于蒽醌類染料結(jié)構(gòu)復(fù)雜難降解，對(duì)漆酶有一定的抗性。不過(guò)也有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過(guò)對(duì)漆酶進(jìn)行固定化，RB亮藍(lán)的脫色效率可以從74.6%提高到90.3%［40］。真菌產(chǎn)生的漆酶對(duì)不同染料具有較好的降解效果，可有效用于工業(yè)染料廢水的處理，然而當(dāng)廢水pH呈堿性時(shí)其應(yīng)用便會(huì)受到限制。

4 結(jié)論

短小芽孢桿菌LC01的重組漆酶具有較高的胞外表達(dá)量，并且在高溫和堿性條件下保持穩(wěn)定的催化活性。在介體乙酰丁香酮的協(xié)助下，對(duì)幾種不同結(jié)構(gòu)的工業(yè)染料（RB亮藍(lán)、活性黑5和靛紅）在堿性條件下均有較好的降解作用。

［1］Jones SM, Solomon EI. Electron transfer and reaction mechanism of laccases［J］. Cellular and Molecular Life Sciences, 2015, 72（5）：869-883.

［2］Pezzella C, Guarino L, Piscitelli A. How to enjoy laccases［J］.Cellular and Molecular Life Sciences, 2015, 72（5）：923-940.

［3］Torressalas P, Mate DM, Ghazi I, et al. Widening the pH activity profile of a fungal laccase by directed evolution［J］.ChemBioChem, 2013, 14（8）：934-937.

［4］Martins LO, Dur?o P, et al. Laccases of prokaryotic origin ：enzymes at the interface of protein science and protein technology［J］.Cellular and Molecular Life Sciences, 2015, 72（5）：911-922.

［5］Tan IS, Ramamurthi KS. Spore formation inBacillus subtilis［J］.Environmental Microbiology Reports, 2014, 6（3）：212-215.

［6］ Kalyani DC, Munk L, et al. Molecular and biochemical characterization of a new thermostable bacterial laccase fromMeiothermus ruberDSM 1279［J］. RSC Advances, 2015, 6（5）：3910-3918.

［7］Gunne M, Al-Sultani D, Urlacher VB, et al. Enhancement of copper content and specific activity of CotA laccase fromBacillus licheniformisby coexpression with CopZ copper chaperone inE.coli［J］. Journal of Biotechnology, 2013, 168（3）：252-255.

［8］Rosano GL, Ceccarelli EA. Recombinant protein expression inEscherichia coli：advances and challenges［J］. Frontiers in Microbiology, 2014, 5（172）：172-184.

［9］Lu L, Zhao M, Wang TN, et al. Characterization and dye decolorization ability of an alkaline resistant and organic solvents tolerant laccase fromBacillus licheniformisLS04［J］. Bioresour Technol, 2012, 115（13）：35-40.

［10］ Reiss R, Ihssen J, Th?ny-Meyer L.Bacillus pumiluslaccase：a heat stable enzyme with a wide substrate spectrum［J］. BMC Biotechnology, 2011, 11（1）：9-20.

［11］Guan ZB, Song CM, Zhang N, et al. Overexpression,characterization, and dye-decolorizing ability of a thermostable, pH-stable, and organic solvent-tolerant laccase fromBacillus pumilusW3［J］. J Mol Catal B Enzym, 2014, 101（1-2）：1-6.

［12］Mate DM, Alcalde M. Laccase engineering：from rational design to directed evolution［J］. Biotechnology Advances, 2015, 33（1）：25-40.

［13］Guan ZB, Zhang N, Song CM, et al. Molecular cloning,characterization, and dye-decolorizing ability of a temperature- and pH-stable laccase fromBacillus subtilisX1［J］. App Biochem Biotechnol, 2014, 172（3）：1147-1157.

［14］Molinaguijarro JM, Mu?ozdorado J, Pérez J, et al. Detoxification of azo dyes by a novel pH-versatile, salt-resistant laccase fromStreptomyces ipomoea［J］. International Microbiology, 2009, 12（1）：13-21.

［15］Pereira L, Coelho AV, et al. Enzymatic biotransformation of the azo dye Sudan Orange G with bacterial CotA-laccase［J］. Journal of Biotechnology, 2009, 139（1）：68-77.

［16］Lon?ar N, Bo?i? N, Lopez-Santin J, et al.Bacillus amyloliquefacienslaccase-from soil bacteria to recombinant enzyme for wastewater decolorization［J］. Bioresour Technol, 2013, 147：177-183.

［17］Krainer FW, Dietzsch C, et al. Recombinant protein expression inPichia pastorisstrains with an engineered methanol utilization pathway［J］. Microbial Cell Factories, 2012, 11（1）：22-36.

［18］Lu L, Wang TN, et al. Cloning and expression of thermo-alkalistable laccase ofBacillus licheniformisinPichia pastorisand its characterization［J］. Bioresour Technol, 2013, 134（5）：81-86.

［19］Chen B, Xu WQ, Pan XR, et al. A novel non-blue laccase fromBacillus amyloliquefaciens：secretory expression and characterization［J］. International Journal of Biological Macromolecules, 2015, 76：39-44.

［20］Zhang ZH, Yang SS, Zhang AL. Using pGAP promoter to express of laccase gene fromBacillus subtilisinP. pastoris［J］.Biotechnology, 2011, 21（6）：24-27.

［21］Manu B, Chaudhari S. Anaerobic decolorisation of simulated textile wastewater containing azo dyes［J］. Bioresour Technol, 2002, 82（3）：225-231.

［22］Jimenez-Juarez N, Roman-Miranda R, Baeza A, et al. Alkali and halide-resistant catalysis by the multipotent oxidase fromMarinomonas mediterranea［J］. Journal of Biotechnology, 2005,117（1）：73-82.

［23］Callejón S, Sendra R, Ferrer S, et al. Cloning and characterization of a new laccase fromLactobacillus plantarumJ16 CECT 8944 catalyzing biogenic amines degradation［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2016, 100（7）：3113-3124.

［24］Rezaei S, Shahverdi AR, Faramarzi MA. Isolation, one-step affinity purification, and characterization of a polyextremotolerant laccase from the halophilic bacteriumAquisalibacillus elongatusand its application in the delignification of sugar beet pulp［J］. Bioresour Technol, 2017, 230：67-75.

［25］Safary A, Moniri R, Hamzeh-Mivehroud M, et al. A strategy for soluble overexpression and biochemical characterization of halothermotolerantBacilluslaccase in modifiedE. coli［J］. Journal of Biotechnology, 2016, 227：56-63.

［26］Liu Y, Huang L, Guo W, et al. Cloning, expression, and characterization of a thermostable and pH-stable laccase fromKlebsiella pneumoniaeand its application to dye decolorization［J］. Process Biochemistry, 2016, 53：125-134.

［27］Yuan X, Tian G, Zhao Y, et al. Biochemical characteristics of three laccase isoforms from the basidiomycetePleurotus nebrodensis［J］. Molecules, 2016, 21（2）：203-218.

［28］Halaburgi VM, Sharma S, Sinha M, et al. Purification and characterization of a thermostable laccase from the ascomycetesCladosporium cladosporioidesand its applications［J］. Process Biochemistry, 2011, 46（5）：1146-1152.

［29］Ricklefs E, Koschorreck K, Winkler N, et al. Expanding the laccase-toolbox：a laccase fromCorynebacterium glutamicumwith phenol coupling and cuprous oxidase activity［J］. Journal of Biotechnology, 2014, 191：46-53.

［30］Lon?ar N, Bo?i? N, Vuj?i? Z. Expression and characterization of a thermostable organic solvent-tolerant laccase fromBacillus licheniformisATCC 9945a［J］. J Mol Catal B Enzym, 2016,134：390-395.

［31］Pawlik A, Wójcik M, Rulka K, et al. Purification and characterization of laccase fromSinorhizobium melilotiand analysis of thelaccgene［J］. International Journal of Biological Macromolecules, 2016, 92：138-147.

［32］Sondhi S, Sharma P, Saini S, et al. Purification and characterization of an extracellular, thermo-alkali-stable, metal tolerant laccase fromBacillus tequilensisSN4［J］. PLoS One, 2014, 9（5）：e96951.

［33］Yavuz M, Kaya G, Aytekin ?. UsingCeriporiopsis subvermisporaCZ-3 laccase for indigo carmine decolourization and denim bleaching［J］. International Biodeterioration and Biodegradation,2014, 88（1）：199-205.

［34］Pan K, Zhao N, et al. Induction of a laccase Lcc9 fromCoprinopsis cinereaby fungal coculture and its application on indigo dye decolorization［J］. Bioresour Technol, 2014, 162（6）：45-52.

［35］Cho EA, Seo J, Lee DW, et al. Decolorization of indigo carmine by laccase displayed onBacillus subtilisspores［J］. Enzyme Microb Technol, 2011, 49（1）：100-104.

［36］Koschorreck K, Wahrendorff F, Biemann S, et al. Cell thermolysis-A simple and fast approach for isolation of bacterial laccases with potential to decolorize industrial dyes［J］. Process Biochemistry, 2017, 56：171-176.

［37］Shi X, Liu Q, Ma J, et al. An acid-stable bacterial laccase identified from the endophytePantoea ananatisSd-1 genome exhibiting lignin degradation and dye decolorization abilities［J］. Biotechnology Letters, 2015, 37（11）：2279-2288.

［38］Liu H, Cheng Y, Du B, et al. Overexpression of a novel thermostable and chloride-tolerant laccase fromThermus thermophilusSG0.5JP17-16 inPichia pastorisand its application in synthetic dye decolorization［J］. PLoS One, 2015, 10（3）：e0119833.

［39］Afreen S, Bano F, Ahmad N, et al. Screening and optimization of laccase from cyanobacteria with its potential in decolorization of anthraquinonic dye Remazol Brilliant Blue R［J］. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2017, 10（5）：403-410.

［40］Dassi D, Rodríguez-Couto S, Nasri M, et al. Biodegradation of textile dyes by immobilized laccase fromCoriolopsis gallicainto Ca-alginate beads［J］. International Biodeterioration and Biodegradation, 2014, 90（1）：71-78.