高原 王福玲 徐蓓蕾 雒江菡 閻力君 趙瑩瑩 王越

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院 細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所，哈爾濱 150076）

葡萄酒在生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生各種各樣的副產(chǎn)物，如葡萄籽、葡萄皮等，葡萄籽在葡萄皮渣這些副產(chǎn)物中高達(dá)到65%左右。葡萄籽中含有豐富的蛋白質(zhì)、纖維素、脂肪、礦物質(zhì)和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，還富含白藜蘆醇［1］。白藜蘆醇是一類多酚類化合物，具有廣泛的抗癌、抗氧化、抗炎等作用。在清除自由基、保持機(jī)體自由基動(dòng)態(tài)平衡，延緩衰老方面也發(fā)揮著重要作用［2-3］。酒精是葡萄酒中的主要成分之一，急性酒精攝入對(duì)肝臟具有顯著的脂質(zhì)過(guò)氧化作用。目前，酒精對(duì)肝臟的影響及酒精性肝病發(fā)病機(jī)制的研究多集中于短期、急性酒精攝入方面，而有關(guān)白藜蘆醇與酒精對(duì)LO2肝細(xì)胞氧化損傷模型的構(gòu)建及氧化損傷保護(hù)作用的研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)酒精誘導(dǎo)構(gòu)建LO2細(xì)胞的氧化損傷模型，并通過(guò)D-半乳糖構(gòu)建衰老小鼠模型，采用白藜蘆醇提取物干預(yù)后，對(duì)細(xì)胞及小鼠肝勻漿超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-px）、丙二醛（MDA）含量進(jìn)行測(cè)定，探討白藜蘆醇提取物對(duì)肝細(xì)胞損傷及延緩衰老的作用，旨為其抗氧化損傷機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 LO2細(xì)胞，哈爾濱商業(yè)大學(xué)細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所保存。

1.1.2 動(dòng)物 昆明種健康小鼠，購(gòu)自長(zhǎng)春億斯。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)材料 葡萄籽（購(gòu)自哈爾濱家樂(lè)福超市）；白藜蘆醇（≥98%，西安玉泉生物科技有限公司）；四甲基氮唑鹽（Sigma公司）；RPMI1640 培養(yǎng)基（四季青）；雙抗（碧云天）；胎牛血清（Hyclone）；MDA、SOD 和GSH-Px試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 SX-700型高壓滅菌鍋（TOMY）；高 效 液 相 色 譜 儀 Agilent1200（Agilent）； 質(zhì)譜 儀 API3000（Applied Biosystems）； 酶 標(biāo) 儀ELx800（BioTek），CO2培 養(yǎng) 箱（memmert）； 生物安全柜（Airstream）紫外分光光度計(jì)（HALO DynamicaDB-20），電熱恒溫水浴鍋（上海華運(yùn)分析儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 葡萄籽中白藜蘆醇的提取及檢測(cè) 將葡萄籽經(jīng)過(guò)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)80目篩之后，準(zhǔn)確稱取粉碎后的葡萄籽樣品。分別通過(guò)乙醇浸提法、熱回流提取、超聲波輔助提取、超聲波輔助雙水相提取等方法對(duì)葡萄籽中的白藜蘆醇進(jìn)行提取。超聲波輔助雙水相提取是在葡萄籽樣品中加入一定量的乙醇-硫酸銨雙水相體系溶劑放入恒溫水浴鍋內(nèi)浸提，取出后用超聲提取。提取完畢后料液經(jīng)抽濾后，得到上下相，上相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得葡萄籽粗提物。將粗提物用乙醇溶解，備用［4-7］。每種方法均取10.00 g葡萄籽粉末于三角瓶中，液料比為1∶10、浸提時(shí)間40 min、超聲功率300 W、超聲溫度50℃、超聲時(shí)間10 min，雙水相體系為（乙醇：硫酸銨=1∶1），處理后抽濾獲取上清液濃縮后乙醇溶解。

HPLC檢測(cè)條件及定量方法如下：安捷倫1200高效液相色譜儀；HIQ Sil C18W（250 mm × 4.6 mm，5 μm）色譜柱；檢測(cè)波長(zhǎng)為291 nm；檢測(cè)溫度為35℃；流動(dòng)相為乙腈-水（26∶74）；流速為1 mL/min。采用外標(biāo)法進(jìn)行定量［8］。通過(guò)檢測(cè)白藜蘆醇的含量計(jì)算白藜蘆醇提取率計(jì)算公式如下：

式中：m為葡萄籽粗粉質(zhì)量（g）；C為葡萄籽樣品溶液濃度（μg/mL）；V為提取后濾液體積（mL）；n為濾液中白藜蘆醇的含量。

1.2.2 LO2細(xì)胞的培養(yǎng)與藥效學(xué)檢測(cè) 細(xì)胞株培養(yǎng)于含10% 胎牛血清與1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿后，用0. 25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。按如下方法進(jìn)行MTT法細(xì)胞抑制率檢測(cè)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LO2細(xì)胞，使用含有10%胎牛血清與1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋成1×104個(gè)細(xì)胞/mL；將200 μL細(xì)胞懸液分別加入96孔板每個(gè)孔中，置于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔中加入不同濃度的白藜蘆醇提取物，稀釋至需要的工作濃度（0、5、10、20、40、80 μg/mL）。置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。首先加入80 μLDMSO，MTT用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液配成濃度為5 mg/mL的溶液，每孔中加入20 μL，置于37℃、5% CO2孵化培養(yǎng)箱中孵育4 h。吸出上清，加入150 μL DMSO 溶解沉淀物，低速搖床震蕩10 min，OD480nm酶標(biāo)儀檢測(cè)。藥物對(duì)LO2細(xì)胞的存活率公式：

細(xì)胞生長(zhǎng)存活率＝（實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD）× 100%

1.2.3 白藜蘆醇提取物對(duì)酒精誘導(dǎo)LO2細(xì)胞抗氧化酶活力等指標(biāo)的影響 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LO2細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1×104細(xì)胞，培養(yǎng)約12 h后，分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和不同濃度的白藜蘆醇組。陰性對(duì)照組不加受試物；陽(yáng)性對(duì)照組只加入100 mmol/L酒精干預(yù)6 h，白藜蘆醇組（0、5、10、20、40 μg/mL）預(yù)處理12 h，各濃度再加入100 mmol/L酒精作用6 h，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。干預(yù)結(jié)束后用0.01 mol/L PBS清洗2次，然后每孔加入細(xì)胞裂解液100 μL裂解細(xì)胞后于4℃12 000 r/min 離心15 min取得上清，參照試劑盒要求，測(cè)定細(xì)胞中MDA水平、SOD活性、GSH-PX活性等相關(guān)氧化損傷的指標(biāo)［9］。陽(yáng)性對(duì)照藥選取維生素C（0-40 μg/mL）。

1.2.4 衰老小鼠模型的構(gòu)建 參照《藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中的方法造模［10］。昆明種小鼠60只，雌雄各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，平均分為6組，每組各10只小鼠。各組分別作如下處理：（1）正常對(duì)照組，每天注射生理鹽水；（2）D-半乳糖組，每天注射D-半乳糖；（3）維生素E組，每天注射D-半乳糖及灌胃給藥100 mg/kg的維生素E；（4）白藜蘆醇提取物高劑量組，每天注射D-半乳糖及灌胃給藥150 mg/kg白藜蘆醇提取物；（5）白藜蘆醇提取物中劑量組，每天注射D-半乳糖及灌胃給藥100 mg/kg白藜蘆醇提取物；（6）白藜蘆醇提取物低劑量組，每天注射D-半乳糖及灌胃給藥50 mg/kg的白藜蘆醇提取物。生理鹽水和D-半乳糖注射劑量均為100 mg/kg，所有試驗(yàn)動(dòng)物均食用全價(jià)混合飼料，自由攝取和取水，連續(xù)給藥、灌胃10周。

1.2.5 白藜蘆醇提取物對(duì)衰老小鼠肝MDA水平、SOD活性、GSH-PX活性的影響 小鼠猝死后，取肝研磨后，參照試劑盒要求，測(cè)定組織研磨液中MDA水平、SOD活性、GSH-PX活性等相關(guān)氧化損傷的指標(biāo)［11-13］。

1.2.6 白藜蘆醇的純化及質(zhì)譜檢測(cè) 通過(guò)硅膠柱層析法對(duì)白藜蘆醇提取物進(jìn)一步分離純化，硅膠與上樣量比為50∶1，流動(dòng)向?yàn)榧状肌寐确?，梯度洗脫后將目?biāo)組分濃縮并溶解于色譜甲醇，0.22 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理及方法 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用ANOVA方差分析并行方差齊性檢驗(yàn)；結(jié)果以x-±s表示。

2 結(jié)果

2.1 葡萄籽中白藜蘆醇的提取及含量計(jì)算

對(duì)乙醇浸提法、熱回流提取、超聲波輔助提取、超聲波輔助雙水相提取等方法對(duì)葡萄籽中的白藜蘆醇進(jìn)行提取，并通過(guò)檢測(cè)白藜蘆醇的含量計(jì)算白藜蘆醇提取率。

比較幾種提取白藜蘆醇的方法，超聲輔助雙水相提取的方法葡萄籽中白藜蘆醇的提取率較高，提取效果較好。達(dá)到2.408 ±0. 088 mg/g采用超聲波集成乙醇-硫酸銨雙水相體系萃取分離葡萄籽中的白藜蘆醇，同時(shí)具有超聲與雙水相提取的優(yōu)點(diǎn)。具有較好的提取純化效果（圖1）。

圖1 不同提取方法下的白藜蘆醇提取率

2.2 MTT法測(cè)定白藜蘆醇提取物對(duì)LO2細(xì)胞的抑制作用

通過(guò)MTT法測(cè)定了葡萄籽中白藜蘆醇提取物對(duì)LO2細(xì)胞的抑制作用，與空白對(duì)照組相比白藜蘆醇提取物濃度（0、5、10、20、40 μg/mL）保護(hù)組表現(xiàn)為對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用。如圖2所示，在0-40 μg/mL濃度的白藜蘆醇提取物作用下，細(xì)胞的抑制率≤10%，說(shuō)明在0-40 μg/mL濃度下對(duì)白藜蘆醇提取物對(duì)LO2細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用。

2.3 白藜蘆醇提取物對(duì)乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞抗氧化酶活力等指標(biāo)的影響

與空白對(duì)照組比較，乙醇誘導(dǎo)模型組細(xì)胞裂解液中SOD活性明顯降低，GSH-Px活性明顯下降，MDA水平明顯升高。白藜蘆醇提取物作用于LO2細(xì)胞后，能夠降低乙醇誘導(dǎo)損傷引起的丙二醛（MDA）含量的升高，MDA含量由5.26 nmol/mg 蛋白下降為3.44 nmol/mg 蛋白。提高SOD和GSH-Px活性，SOD活性由15.38 U/mg蛋白升高至16.91 U/mg蛋白，GSH-Px活性由6.45U/mg蛋白升高至8.58 U/mg蛋白。且變化趨勢(shì)均呈明顯的劑量依賴性，如圖3所示。與陽(yáng)性對(duì)照維生素C（0-40 μg/mL）結(jié)果呈現(xiàn)一致性，維生素C作用LO2細(xì)胞后，MDA含量下降2.38 nmol/mg蛋白，SOD活性上升3.48 U/mg蛋白，GSHPx活性上升3.83 U/mg蛋白。

圖 2 白藜蘆醇提取物對(duì)LO2細(xì)胞存活率的影響

圖 3 白藜蘆醇提取物對(duì)SOD、GSH-Px活力及MDA水平的影響

2.4 白藜蘆醇提取物對(duì)衰老小鼠肝MDA含量、GSH-Px和SOD活力的影響

本研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇提取物灌胃D-半乳糖致衰小鼠一段時(shí)間后，與衰老模型相比，小鼠肝內(nèi)GSH-Px酶活性略有升高，由905.50±30.85升高到940.25±25.73（U/mg prot）。白藜蘆醇提取物對(duì)小鼠肝中MPA的產(chǎn)生有輕微的抑制作用，與衰老模型組小鼠相比，提取物抑制MDA產(chǎn)生，由8.65±2.98降至 7.96±3.98（nmol/mg prot），3個(gè)劑量組MDA含量差異不明顯。同衰老模型組小鼠相比，白藜蘆醇提取物能顯著增強(qiáng)衰老小鼠肝中SOD活性，且隨著提取物濃度的增大，SOD活性增強(qiáng)，由112.24±19.85升高至142.38±18.85（U/mg prot），高劑量組飼喂小鼠肝臟中SOD活性的增強(qiáng)較顯著（表1）。

表1 白藜蘆醇提取物灌胃后衰老小鼠肝MDA含量及GSH-Px和SOD活性

2.5 白藜蘆醇的純化及質(zhì)譜檢測(cè)

通過(guò)硅膠柱層析法對(duì)白藜蘆醇提取物進(jìn)一步分離純化，洗脫下來(lái)富含白藜蘆醇的組分。通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇純化組分中含有m/z=226.9的色譜峰，與白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品一致，說(shuō)明該組分中富含白藜蘆醇。

3 討論

葡萄籽作為一種葡萄酒產(chǎn)業(yè)的廢棄物，如果能充分利用葡萄籽資源提取白藜蘆醇等多酚類成分，可節(jié)約資源、變廢為寶、保護(hù)環(huán)境。雙水相萃取技術(shù)已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取分離等領(lǐng)域，乙醇-硫酸銨雙水相體系具有黏度小、價(jià)格低、分相清晰、綠色環(huán)保等特點(diǎn)，而超聲波輔助提取具有節(jié)省時(shí)間和溶劑、提取效率高等特點(diǎn)。超聲波輔助雙水相提取葡萄籽中白藜蘆醇的研究較少。卜曉英等［14］在研究雙水相萃取虎杖白藜蘆醇提純工藝中，白藜蘆醇含量為0.694%，李一凡等［15］在研究超聲波輔助提取葡萄芪化物工藝條件中，芪化物提取量可達(dá)104.97 μg/g，張喜峰等［16］在研究乙醇 - 硫酸銨雙水相體系分離純化葡萄籽總黃酮時(shí)發(fā)現(xiàn)，雙水相體系具有良好的黃酮類化合物萃取能力，總黃酮萃取率達(dá)到98.8%。本研究結(jié)合超聲波和雙水相的優(yōu)勢(shì)，白藜蘆醇的提取率達(dá)到了2.408±0.088 mg/g，由于葡萄籽中本身白藜蘆醇的含量與虎杖也有所差別，所以與卜曉英的研究相比提取率略低，但與李一凡的研究相比，提取率較高。對(duì)于葡萄籽提取物對(duì)酒精誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞以及衰老小鼠模型中SOD、GSH-px和MDA含量的影響可反應(yīng)出葡萄籽提取物的抗氧化及保護(hù)細(xì)胞與機(jī)體防御氧化應(yīng)激損傷的能力。對(duì)于這部分的研究目前也較少，周曉云等［17］研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對(duì)小鼠酒精性肝損傷有抑制作用，因而對(duì)肝細(xì)胞起保護(hù)作用，與本研究結(jié)果一致。白藜蘆醇的功能目前已經(jīng)受到了人們的廣泛認(rèn)可。本課題組也將對(duì)白藜蘆醇的保護(hù)細(xì)胞氧化損傷機(jī)理及延緩衰老功能機(jī)理進(jìn)一步深入研究。

圖 4 白藜蘆醇及白藜蘆醇純化組分的質(zhì)譜圖

4 結(jié)論

本研究通過(guò)超聲波輔助雙水相法對(duì)葡萄酒產(chǎn)業(yè)廢棄物葡萄籽進(jìn)行白藜蘆醇的提取純化，白藜蘆醇提取率達(dá)到2.408±0.088 mg/g。白藜蘆醇提取物降低了乙醇誘導(dǎo)引起的丙二醛含量升高，且能顯著提高SOD和GSH-px的活性。白藜蘆醇提取物對(duì)衰老模型小鼠肝中丙二醛的產(chǎn)生有一定的抑制作用，且能夠提升SOD和GSH-px的活性。

［1］賈榮. 山葡萄籽提取物及抗氧化活性的研究［D］. 長(zhǎng)春：吉林大學(xué), 2010.

［2］夏蘭蘭, 張雅麗, 朱磊, 等. 葡萄籽多酚化合物抗氧化能力與抗癌細(xì)胞增殖活性的評(píng)價(jià)［J］. 食品科技, 2011（11）：174-178.

［3］劉以娟, 范方輝, 王芳兵, 等. 葡萄籽提取物體外抗氧化活性的研究［J］. 食品工業(yè)科技, 2012（18）：143-151.

［4］張喜峰, 李彩霞, 張瑾, 等. 超聲集成雙水相體系提取葡萄籽中的原花青素［J］. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā), 2013, 25：444-449.

［5］胡佳欽, 向福, 石長(zhǎng)萍, 等. 金銀花中綠原酸的雙水相萃取及抗氧化能力研究［J］. 中國(guó)釀造, 2014, 34（12）：109-112.

［6］陳姍姍, 王丹, 張超, 等. 紫甘薯花色苷在雙水相萃取體系中的分配特性［J］. 食品科學(xué), 2013, 34（19）：76-79.

［7］李超, 等. 超聲強(qiáng)化亞臨界水提取脫脂葡萄籽中原花青素的工藝及其抗氧化研究［J］. 中國(guó)中藥雜志, 2010（8）：967-972.

［8］曹雪杰, 高明波, 樸晶晶. 雙水相萃取雙優(yōu)紅葡萄籽中的白藜蘆醇［J］. 廣州化工 , 2015, 43（11）：65-67.

［9］黃娜娜. 柑橘精油抗氧化特性及對(duì)皮膚細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用研究［D］. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016.

［10］徐叔云, 卞如鐮, 陳修. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］. 第2版. 北京：人民衛(wèi)生出版社, 2008：1465-1466.

［11］ 王玉嬌. 草蓯蓉多糖對(duì)肝細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用［D］. 延邊：延邊大學(xué), 2014.

［12］ 周玲芝. 白藜蘆醇酒劑對(duì)老齡小鼠MDA、SOD和GSH-PX的影響［J］. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 30（7）：45-46.

［13］趙旭, 劉壽榮, 馮仙菊, 等. 從氧化應(yīng)激談白藜蘆醇對(duì)高尿酸介導(dǎo)的非酒精性脂肪肝大鼠的影響［J］. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2016, 34（5）：1193-1195.

［14］卜曉英, 姚姝鳳, 許新軍. 微波程序控溫控壓輔助雙水相萃取虎杖果實(shí)中白藜蘆醇與大黃素的研究［J］. 林產(chǎn)業(yè)化學(xué)與工業(yè),2016, 36（5）：113-119.

［15］李一凡, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取玫瑰香葡萄中芪化物的工藝條件［J］. 食品工業(yè)科技, 2016（20）：258-262.

［16］張喜峰, 楊春慧, 等. 乙醇/硫酸銨雙水相體系分離純化葡萄籽總黃酮［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2013（10）：254-258.

［17］周曉云, 崔曉明, 崔國(guó)金, 等. 白藜蘆醇對(duì)小鼠酒精性肝損傷的抑制作用［J］. 河北聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版 , 2014, 16（1）：3-5.