王晨 汪嘉琪 趙亮， 范里， 劉旭平， 陳敏 張理想 譚文松，

（1. 華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2. 上海倍諳基生物科技有限公司，上海 200237）

抗體類藥物因其高特異性、親和性及安全性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于針對(duì)人類自身免疫性疾病、癌癥類疾病及各種炎癥類疾病的治療過程中。應(yīng)用動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)抗體類藥物已成為生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)主流生產(chǎn)技術(shù)［1］。伴隨細(xì)胞高密度及大規(guī)模培養(yǎng)，反應(yīng)器內(nèi)的二氧化碳分壓（pCO2）的累積情況顯著增加，甚至到達(dá)200 mmHg，顯著高于生理水平（31-54 mmHg）［2］。過高的 pCO2除了可以抑制細(xì)胞生長、代謝和降低產(chǎn)率之外，對(duì)產(chǎn)物糖基化修飾也存在不利影響［3-6］。

除此之外，伴隨著培養(yǎng)過程中CO2的大量累積，培養(yǎng)體系逐漸酸化。為有效控制培養(yǎng)體系pH，只能增加補(bǔ)堿量，進(jìn)而導(dǎo)致體系中滲透壓持續(xù)升高［7］。而作為另一個(gè)重要的培養(yǎng)過程變量，滲透壓的升高也會(huì)對(duì)細(xì)胞生長、代謝和產(chǎn)率產(chǎn)生不利影響［4-5，8］。由于細(xì)胞高密度維持主要集中在流加培養(yǎng)后期（產(chǎn)物表達(dá)期）及灌注培養(yǎng)過程中，這一階段的二氧化碳累積和滲透壓升高問題更應(yīng)該被關(guān)注。因此全面且深入的研究pCO2和滲透壓升高對(duì)產(chǎn)物表達(dá)期細(xì)胞生長維持、產(chǎn)物表達(dá)及產(chǎn)品質(zhì)量的影響，對(duì)于表達(dá)重組蛋白藥物的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝優(yōu)化放大和工業(yè)化生產(chǎn)過程的有效控制具有重要的參考價(jià)值。

為此，本研究以表達(dá)單克隆抗體的CHO細(xì)胞為研究對(duì)象，考察了不同pCO2和滲透壓水平下，細(xì)胞生長、代謝和產(chǎn)物表達(dá)及產(chǎn)品質(zhì)量的情況，深入了解了pCO2和滲透壓升高對(duì)產(chǎn)物表達(dá)過程的影響，以期為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝放大過程中風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估奠定部分基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用細(xì)胞株為表達(dá)單克隆抗體（CD20）的重組CHO細(xì)胞株，該細(xì)胞株是在原始細(xì)胞株CHO-K1基礎(chǔ)上共轉(zhuǎn)染抗CD20重鏈、輕鏈和二氫葉酸還原酶（DHFR）基因，通過氨甲喋呤（MTX）加壓篩選獲得［9］。所使用的培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)室自主開發(fā)的培養(yǎng)基［10］。培養(yǎng)基配制所需試劑均購于Sigma-Aldrich公司。培養(yǎng)基配制完后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜（Millipore）過濾除菌后使用。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)方法

1.2.1.1 種子細(xì)胞培養(yǎng) 從細(xì)胞庫中復(fù)蘇重組CHO細(xì)胞，以5.0×105cells/mL的活細(xì)胞密度接種于50 mL細(xì)胞培養(yǎng)管（TPP），接種體積為20 mL，置于37℃、5%的CO2條件下進(jìn)行懸浮擴(kuò)增培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min。每隔2 d進(jìn)行種子細(xì)胞傳代擴(kuò)增，傳代后活細(xì)胞密度控制在5.0×105cells/mL左右。

1.2.1.2 批式培養(yǎng) 取指數(shù)生長期的CHO種子細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min后，棄培養(yǎng)上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以1×106cells/mL的活細(xì)胞密度接種于1 L（Corning）搖瓶，接種體積為300 mL。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，流加培養(yǎng)至5 d，將細(xì)胞懸液1 000 r/min離心5 min后，棄培養(yǎng)上清，重懸于預(yù)平衡后的新鮮實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基內(nèi)。選取pCO2為40 mmHg（正常分壓組）和150 mmHg（高分壓組），滲透壓為300、350、400、450 mOsm/kg這幾組培養(yǎng)條件進(jìn)行研究，采用正交法考察兩者對(duì)CHO細(xì)胞產(chǎn)物表達(dá)的影響。通過調(diào)整培養(yǎng)基中NaHCO3的濃度及培養(yǎng)箱內(nèi)CO2含量實(shí)現(xiàn)不同的pCO2條件，當(dāng)NaHCO3添加量為2.2和5.5 g/L時(shí)，平衡后與之對(duì)應(yīng)的pCO2分別為40 mmHg和150 mmHg。實(shí)驗(yàn)中滲透壓用NaCl進(jìn)行調(diào)整。將裝有重懸后的細(xì)胞懸液的搖瓶分別置于32℃、5%或20% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱重新進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。培養(yǎng)過程中第0、1、3、5、7、9天分別取細(xì)胞懸液1 mL進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，經(jīng)10 000 r/min離心5 min后，取上清保存于-80℃，用于后期抗體產(chǎn)量和胞外代謝物濃度的檢測。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 基礎(chǔ)分析方法 細(xì)胞密度及活性首先用臺(tái)盼藍(lán)染色后，采用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。葡萄糖、乳酸、氨、谷氨酰胺和谷氨酸濃度采用NOVA Bioprofile 400生化分析儀檢測。產(chǎn)物濃度采用Protein A-HPLC（Applied Biosystems） 方 法［11］檢測。上清收獲后采用rProtein A 親和層析柱（GE Healthcare）純化并收集抗體。

1.2.2.2 胞內(nèi)代謝物提取及檢測方法 取1×107個(gè)細(xì)胞進(jìn)行胞內(nèi)物質(zhì)淬滅及提取，采用含1 μmol/L十四酸為內(nèi)標(biāo)的50%（V/V）乙腈水溶液的提取方法［12］。提取的胞內(nèi)代謝物溶液采用SpeedVac（Thermo）進(jìn)行真空離心濃縮至干粉后，保存于-80℃待測。干燥后的胞內(nèi)代謝物首先使用甲氧胺鹽酸鹽進(jìn)行酮基保護(hù)后，經(jīng)MSTFA進(jìn)行硅烷化衍生，使用安捷倫6890氣象色譜（GC）加5975四級(jí)桿質(zhì)量檢測器（EI）（MS）進(jìn)行分離及定量，氣象分離采用HP-5毛細(xì)管為分離柱（30 m×0.25 mm，膜厚0.25 μm），具體分離方法如文獻(xiàn)所述［13］。

1.2.2.3 HPLC法檢測抗體電荷異質(zhì)性 抗體電荷異質(zhì)性采用弱陽離子交換色譜進(jìn)行分離及檢測［14］。

1.2.2.4 HPLC法檢測抗體糖基化 抗體糖基化檢測采用2-對(duì)氨基苯甲酰胺（2-AB）標(biāo)記試劑盒（Prozyme）法進(jìn)行檢測［15］。簡單來說首先用N-糖酰胺酶（PNGase F）將N-糖從60 μg抗體上解離下來，然后采用2-AB熒光染料標(biāo)記后，使用TSK-GEL Amide-80（4.6×250 mm）色譜柱進(jìn)行分離。流動(dòng)相分別為A（125 mmol/L 甲酸銨，pH4.4）和B（100%乙腈），分離條件為：（1）30%-40% 線性梯度洗脫A 90 min；（2）40%-46% 線性梯度洗脫 A 54 min；（3）46%-95% 線性梯度洗脫 A 1 min；（4）95%-100%線性梯度洗脫A 3 min；（5）100%-30% 線性梯度洗脫A 4 min，流速為0.4 mL/min，檢測器為熒光檢測器。

1.2.2.5 數(shù)據(jù)分析 抗體比生成速率及營養(yǎng)物和代謝物的比消耗速率采用濃度與IVCC（活細(xì)胞密度對(duì)時(shí)間的積分）擬合的方法［16］進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 pCO2和滲透壓對(duì)CHO細(xì)胞生長和抗體表達(dá)的影響

首先以1×106cells/mL的活細(xì)胞密度接種于1 L（Corning）搖瓶中，接種體積為300 mL。細(xì)胞在前2 d內(nèi)快速生長，最大比生長速率為0.89±0.22 day-1，并于第4天達(dá)到最高細(xì)胞密度為（45.1±8）×105cells/mL后細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定維持期。圖1-A所示為CHO細(xì)胞在不同條件下的細(xì)胞維持曲線。如圖所示，由于采用換液培養(yǎng)的手段，細(xì)胞在降溫32℃條件下，細(xì)胞密度在pCO2和滲透壓較低的情況下培養(yǎng)第6 d出現(xiàn)了明顯上升，但隨著滲透壓的升高，細(xì)胞后期的維持密度下降，其中有3組實(shí)驗(yàn)組（Osm450-150，Osm400-40和Osm450-40）在第6天細(xì)胞密度僅出現(xiàn)維持狀態(tài)。在相同滲透壓情況下，隨著pCO2的升高，細(xì)胞的后期維持有所改善。

圖1 不同pCO2和滲透壓條件下細(xì)胞維持（A）、抗體濃度（B）及抗體比生產(chǎn)速率（C）

圖1-B、C分別是CHO細(xì)胞在不同條件下的產(chǎn)量和產(chǎn)物比生成速率（qp）的數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，在350 mOsm/kg和40 mmHg下，產(chǎn)物的最終表達(dá)量最高（2.03 g/L），在此pCO2下，隨著滲透壓的升高，細(xì)胞的產(chǎn)量成比例下降至最低49.2%。而將pCO2提高至150 mmHg時(shí)，產(chǎn)量整體下降，其中在300 mOsm/kg和450 mOsm/kg時(shí)，相較于350 mOsm/kg和40 mmHg這一培養(yǎng)條件下產(chǎn)量，分別下降至62.6%和27%。

此外，通過對(duì)比不同條件下產(chǎn)物比生成速率可以看出，正常分壓組內(nèi)滲透壓改變對(duì)產(chǎn)物的比生成速率變化沒有顯著影響（P＜0.05），產(chǎn)物平均比生成速率為35.7 pg/cell·day-1。同時(shí)，高pCO2抑制了產(chǎn)物比生成速率，在450 mOsm/kg時(shí)，相較于350 mOsm/kg和40 mmHg條件下qp，最大下降至52%。此外，在高分壓組內(nèi)，提高滲透壓至450 mOsm/kg時(shí)，相對(duì)于350 mOsm/kg條件下，細(xì)胞的產(chǎn)物比生成速率由24.4 pg/cell·day-1明顯下降至16 pg/cell·day-1。

圖2 不同pCO2和滲透壓下CHO細(xì)胞葡萄糖和谷氨酰胺比消耗速率（A）、乳酸和氨比消耗速率（B）以及乳酸得率（C）情況

2.2 pCO2和滲透壓對(duì)CHO細(xì)胞代謝的影響

圖2-A、B是不同pCO2和滲透壓水平下，CHO細(xì)胞胞外葡萄糖（Gluc）、谷氨酰胺（Gln）、乳酸（Lac）和氨離子（NH4+）消耗速率的數(shù)據(jù)。隨著滲透壓的升高，細(xì)胞的谷氨酰胺和葡萄糖的消耗速率逐漸增加。但是在正常分壓組下，細(xì)胞滲透壓從400 mOsm/kg升高至450 mOsm/kg時(shí)，葡萄糖消耗速率減少。同時(shí)，在高pCO2組和正常pCO2組內(nèi)，隨著滲透壓的升高，胞外的氨和乳酸比生成速率持續(xù)增加，尤其在正常分壓組內(nèi)，隨著滲透壓的升高，乳酸則是完成了從消耗向生成的逆轉(zhuǎn)。在滲透壓一致的條件下，培養(yǎng)環(huán)境中的pCO2升高對(duì)谷氨酰胺和氨的代謝無顯著影響，但是對(duì)乳酸和葡萄糖代謝影響顯著。在300 和350 mOsm/kg下，不同pCO2下細(xì)胞的胞外葡萄糖的代謝情況較一致，而乳酸代謝則為相反代謝狀態(tài)。在400和450 mOsm/kg 高pCO2下，其葡萄糖的消耗速率明顯下降，乳酸的生成速率明顯提高。通過進(jìn)一步比較乳酸對(duì)于葡萄糖的得率（YLac/Gluc）（圖2-C）可知，在高分壓下，不論滲透壓水平如何變化，乳酸的得率相較正常分壓組明顯升高；在正常分壓組內(nèi)，隨著滲透壓的升高，乳酸得率越來越高，但最高僅為450 mOsm/kg和150 mmHg組乳酸得率的18%。

除此之外，進(jìn)一步考察不同條件下細(xì)胞的胞內(nèi)代謝物情況。圖3是不同pCO2和滲透壓水平下，CHO細(xì)胞胞內(nèi)各種代謝物在培養(yǎng)第10 d的相對(duì)含量圖。如圖所示，在正常pCO2組內(nèi)，隨著滲透壓的升高，胞內(nèi)物質(zhì)含量總體升高；在高pCO2組內(nèi)，滲透壓升高至450 mOsm/kg后，胞內(nèi)物質(zhì)含量為組內(nèi)相對(duì)濃度最高組。而在相同滲透壓下，分壓越高，胞內(nèi)物質(zhì)的含量越低，尤其以各類氨基酸和糖類為主要降低對(duì)象。其中乳酸含量在正常pCO2組內(nèi)，隨著滲透壓的升高出現(xiàn)了明顯累積，在高pCO2組內(nèi)，當(dāng)滲透壓達(dá)到450 mOsm/kg時(shí)，也出現(xiàn)了濃度的升高；而當(dāng)滲透壓≥350 mOsm/kg時(shí)，在高pCO2組內(nèi)乳酸的含量均低于正常pCO2組。觀察3個(gè)TCA循環(huán)中間代謝物琥珀酸、檸檬酸和蘋果酸的含量，可以得出提高環(huán)境中的pCO2可以提高琥珀酸胞內(nèi)含量并減少檸檬酸含量（除400 mOsm/kg和150 mmHg條件），同時(shí)在正常pCO2情況下提高滲透壓則會(huì)促進(jìn)蘋果酸的累積。結(jié)合胞內(nèi)和胞外的代謝情況可知，滲透壓及二氧化碳分壓升高均會(huì)對(duì)細(xì)胞代謝產(chǎn)生復(fù)雜且顯著的影響，伴隨胞外葡萄糖和谷氨酰胺的消耗量增高，胞內(nèi)物質(zhì)濃度也大致出現(xiàn)相應(yīng)的增加的現(xiàn)象。

圖3 不同pCO2和滲透壓下CHO細(xì)胞胞內(nèi)物質(zhì)相對(duì)含量

2.3 pCO2和滲透壓對(duì)CHO細(xì)胞產(chǎn)物產(chǎn)品質(zhì)量的影響

2.3.1 pCO2和滲透壓對(duì)CHO細(xì)胞產(chǎn)物糖基化的影響 表1為不同pCO2和滲透壓下，最終收獲的抗體上各種糖型結(jié)構(gòu)的分布比例。如表所示，在相同的pCO2下，隨著滲透壓的升高，產(chǎn)物的甘露糖糖型含量升高，且半乳糖糖型含量下降，其中G1F的含量明顯下降。而在相同滲透壓下，二氧化碳含量的升高未導(dǎo)致各類糖型含量的明顯變化。

2.3.2 pCO2和滲透壓對(duì)CHO細(xì)胞產(chǎn)物電荷水平的影響 圖4為不同 pCO2和滲透壓水平下，產(chǎn)物的最終電荷分布情況。如圖所示，在正常pCO2組內(nèi)，滲透壓從300 mOsm/kg升至450 mOsm/kg可以促進(jìn)主峰含量升高43%；在高pCO2組內(nèi)，同樣梯度的滲透壓升高也可促進(jìn)主峰含量升高17%。與此同時(shí)，在同一pCO2組內(nèi)，滲透壓的升高導(dǎo)致酸性峰比例逐漸減少；在正常pCO2條件下，滲透壓升高還會(huì)導(dǎo)致堿性峰含量的逐漸下降。

表1 不同pCO2和滲透壓下產(chǎn)物糖型分布

在滲透壓相同的情況下，高pCO2下，其主峰含量變少；且滲透壓越高時(shí)，主峰含量差異越大，最大至降低20%（450 mOsm/kg）。其中在滲透壓較低的范圍（300，350 mOsm/kg）下，二氧化碳含量升高增加產(chǎn)物酸性峰含量，并減少了產(chǎn)物堿性峰含量；在滲透壓較高的范圍內(nèi)（400和450 mOsm/kg）二氧化碳分壓升高則主要增加其堿性峰的含量。

圖4 不同pCO2和滲透壓下產(chǎn)物電荷分布

3 討論

以攪拌式反應(yīng)器為培養(yǎng)容器，以重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞為表達(dá)載體生產(chǎn)蛋白類藥物已經(jīng)成為生物制藥領(lǐng)域的主流方向之一。在培養(yǎng)規(guī)模放大過程中，隨著細(xì)胞密度的升高，培養(yǎng)體系內(nèi)CO2和滲透壓也逐漸累積，因此pCO2和滲透壓的控制也成為了反應(yīng)器放大過程中的兩個(gè)關(guān)鍵控制參數(shù)。為此，本研究以一株具有工業(yè)化應(yīng)用潛力的表達(dá)抗CD20的dhfr-CHO細(xì)胞為研究對(duì)象，綜合研究了pCO2和滲透壓升高對(duì)細(xì)胞產(chǎn)物生成時(shí)期的生長維持、代謝、抗體表達(dá)和抗體關(guān)鍵質(zhì)量屬性的影響。

細(xì)胞培養(yǎng)過程中的最終產(chǎn)量由兩方面影響，分別為產(chǎn)物比生成速率及累積活細(xì)胞密度（IVCC），其中累積活細(xì)胞密度與后期細(xì)胞活性維持息息相關(guān)。因此本文分別從這兩方面了解pCO2和滲透壓的升高對(duì)最終產(chǎn)量變化的影響。在細(xì)胞維持方面，同等滲透壓下，高pCO2有利于細(xì)胞培養(yǎng)后期的生長維持。本實(shí)驗(yàn)體系中培養(yǎng)基的pH緩沖采用碳酸氫鈉單獨(dú)緩沖的體系，因此在培養(yǎng)pH一致時(shí)，高pCO2對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基中高碳酸氫鈉濃度［6］，高濃度的緩沖體系則意味著更強(qiáng)的pH緩沖能力，從而緩解了培養(yǎng)后期因?yàn)槿樗嵘伤鸬膒H下降而導(dǎo)致的細(xì)胞活性的下降。而在抗體表達(dá)方面，高pCO2顯著降低了細(xì)胞的產(chǎn)物比消耗速率，從而導(dǎo)致最終的產(chǎn)量下降，這一現(xiàn)象和前人報(bào)道一致［5］。

細(xì)胞物質(zhì)及能量代謝過程中作為抗體生成量的代表性指標(biāo)有培養(yǎng)過程中的乳酸代謝和細(xì)胞有氧代謝效率等，在產(chǎn)物高表達(dá)過程中通常伴隨胞外乳酸的消耗［17］和胞內(nèi)有氧糖酵解通路的增強(qiáng)［18］。通過調(diào)研不同pCO2下細(xì)胞胞外代謝物消耗速率和胞內(nèi)代謝物的相對(duì)濃度可以發(fā)現(xiàn)，pCO2升高不利于葡萄糖的消耗，尤其是在滲透壓較高的條件下（400和450 mOsm/kg）；同時(shí)pCO2升高會(huì)顯著加快代謝副產(chǎn)物乳酸的生成，并使胞內(nèi)代謝物的平均含量減少。通過進(jìn)一步計(jì)算乳酸得率（YLac/Gluc），可以觀察到高pCO2組，其乳酸得率明顯升高，這表示消耗單位葡萄糖其生成的乳酸越多，進(jìn)入TCA循環(huán)的比例越低，細(xì)胞的物質(zhì)代謝越低效。而進(jìn)一步觀察胞內(nèi)代謝物含量可以發(fā)現(xiàn)，雖然在高pCO2條件下，多數(shù)胞內(nèi)代謝物含量下降，但胞內(nèi)琥珀酸的含量明顯提高。據(jù)前人報(bào)道，純CO2可以直接抑制胞內(nèi)多種酶，例如，琥珀酸脫氫酶（SDH）［19］和NADPH生成酶［20］，因而胞內(nèi)琥珀酸累積可能和SDH抑制相關(guān)。綜合胞內(nèi)外代謝情況，可以看出高pCO2不利于細(xì)胞進(jìn)行有效的有氧代謝。根據(jù)前人報(bào)道，細(xì)胞的線粒體脫氫酶在調(diào)節(jié)細(xì)胞有氧代謝和無氧代謝中具有重要地位，而其活性同產(chǎn)物比生成速率成正相關(guān)，因此高二氧化碳分壓所導(dǎo)致的細(xì)胞有氧代謝低效也可能是造成產(chǎn)物比生成速率下降的重要原因之一［18］。同時(shí)觀察高pCO2下，產(chǎn)物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（糖型修飾和電荷異質(zhì)性）的變化，不同于文獻(xiàn)關(guān)于糖型修飾的報(bào)道［3］，pCO2的升高對(duì)單抗的糖型結(jié)構(gòu)無顯著影響，但是顯著降低了抗體中性主峰含量［4］。

在相同pCO2內(nèi)，隨著滲透壓的升高，細(xì)胞后期活性和最終產(chǎn)量逐漸下降，產(chǎn)物比生成速率出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。但在正常pCO2組內(nèi)，提高滲透壓對(duì)產(chǎn)物比生成速率的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在高pCO2組內(nèi)，當(dāng)滲透壓升高至400 mOsm/kg時(shí)，產(chǎn)物的比生成速率相對(duì)于150 mOsm/kg組顯著下降。此現(xiàn)象說明在高pCO2條件下，增加培養(yǎng)過程中的滲透壓水平會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)物表達(dá)產(chǎn)生協(xié)同抑制作用。同時(shí)，通過考察同一pCO2不同滲透壓條件下，細(xì)胞的胞外代謝速率和胞內(nèi)物質(zhì)含量可以分析出，滲透壓的升高可以有效促進(jìn)胞外葡萄糖和谷氨酰胺的消耗，并增強(qiáng)乳酸和氨的生成，同時(shí)胞內(nèi)物質(zhì)含量也隨滲透壓的升高而變多。通過進(jìn)一步計(jì)算乳酸得率（YLac/Gluc），可以觀察到提高滲透壓顯著升高了乳酸得率，即降低了細(xì)胞的單位葡萄糖有效利用率。除此之外，CHO細(xì)胞胞內(nèi)ATP供給主要依賴糖酵解途徑［21］。因此，隨著滲透壓的升高其葡萄糖利用速率的增加可有效增加細(xì)胞胞內(nèi)ATP含量，此現(xiàn)象也吻合前人的報(bào)道［8］。上述結(jié)果表明，滲透壓升高在一定程度上刺激了細(xì)胞中心碳代謝通量，因此其產(chǎn)物比生成速率呈現(xiàn)了先升后降的趨勢，但滲透壓對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用可能存在除中心碳代謝之外的作用因素［22］。通過對(duì)比不同滲透壓下產(chǎn)物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，可以看出隨著滲透壓的升高，產(chǎn)物半乳糖基化水平顯著遞減。與此同時(shí)，隨著滲透壓的升高，產(chǎn)物的酸性峰比例下調(diào)，中性峰比例升高，而其堿性峰比例在不同的pCO2條件下呈現(xiàn)了相反的趨勢。

產(chǎn)物表達(dá)是CHO細(xì)胞表達(dá)重組蛋白的重要組成部分，而pCO2和滲透壓是兩個(gè)極易在此過程中累積的關(guān)鍵操作控制參數(shù)，因此通過系統(tǒng)了解pCO2和滲透壓升高對(duì)細(xì)胞各項(xiàng)參數(shù)的影響，有助于我們?cè)谶\(yùn)用QbD（質(zhì)量源于設(shè)計(jì)）方法［23］生產(chǎn)單抗藥物時(shí)，對(duì)pCO2和滲透壓進(jìn)行相應(yīng)的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)定并進(jìn)一步指導(dǎo)放大過程的進(jìn)行。

4 結(jié)論

當(dāng)滲透壓為300 mOsm/kg，pCO2為40 mmHg時(shí)，產(chǎn)物的最終產(chǎn)量最高，細(xì)胞的營養(yǎng)物代謝最高效，產(chǎn)物的糖型修飾也較完整，但是產(chǎn)物的中性電荷主峰含量為最低。在此基礎(chǔ)上提高滲透壓可以有效的增加產(chǎn)物的中性電荷主峰，但是其余參數(shù)水平下調(diào)。pCO2的升高不利于產(chǎn)物表達(dá)和產(chǎn)物產(chǎn)品質(zhì)量。綜合而言，在反應(yīng)器放大的過程應(yīng)當(dāng)盡量避免pCO2和滲透壓的過度累積以保證最終產(chǎn)量最大化。

［1］ Bandaranayake AD, Almo SC. Recent advances in mammalian protein production［J］. FEBS Lett, 2014, 588（2）：253-260.

［2］ Altman PL, Dittmer D. Respiration and Circulation［M］.Federation of American Societies of Experimental Biology, 1971.

［3］ Brunner M, Fricke J, Kroll P, et al. Investigation of the interactions of critical scale-up parameters（pH, pO2and pCO2）on CHO batch performance and critical quality attributes［J］. Bioproc Biosyst Eng, 2017, 40（2）：251-263.

［4］ Schmelzer AE, Miller WM. Hyperosmotic stress and elevated pCO2alter monoclonal antibody charge distribution and monosaccharide content［J］. Biotechnol Progr, 2002, 18（2）：346-353.

［5］ Kimura R, Miller WM. Effects of elevated pCO2and/or osmolality on the growth and recombinant tPA production of CHO cells［J］.Biotechnol Bioeng, 1996, 52：152-160.

［6］ Goudar CT, Matanguihan R, Long E, et al. Decreased pCO2accumulation by eliminating bicarbonate addition to high celldensity cultures［J］. Biotechnol Bioeng, 2007, 96（6）：1107-1117.

［7］ Xing Z, Lewis AM, Borys MC, et al. A carbon dioxide stripping model for mammalian cell culture in manufacturing scale bioreactors［J］.Biotechnol Bioeng, 2017, 114（6）：1184-1194.

［8］ Pfizenmaier J, Matuszczyk JC, Takors R. Changes in intracellular ATP-content of CHO cells as response to hyperosmolality［J］.Biotechnol Progr, 2015, 31（5）：1212-1216.

［9］ Chen F, Fan L, Wang J, et al. Insight into the roles of hypoxanthine and thydimine on cultivating antibody-producing CHO cells：cell growth, antibody production and long-term stability［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 93（1）：169-178.

［10］ 譚文松, 孫亞婷, 趙亮. 適于動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品大規(guī)模生產(chǎn)的化學(xué)成分明確培養(yǎng)基：中國, CN 104328158 A［P］. 2015-02-04.

［11］ Yang JD, Lu C, Stasny B, et al. Fed-batch bioreactor process scaleup from 3-L to 2, 500-L scale for monoclonal antibody production from cell culture［J］. Biotechnol Bioeng, 2007, 98（1）：141-154.

［12］ Dietmair S, Timmins NE, Gray PP, et al. Towards quantitative metabolomics of mammalian cells：development of a metabolite extraction protocol［J］. Anal Biochem, 2010, 404（2）：155-164.

［13］ Zhao C, Nambou K, Wei L, et al. Evaluation of metabolome sample preparation methods regarding leakage reduction for the oleaginous yeastYarrowia lipolytica［J］. Biochem Eng J, 2014, 82：63-70.

［14］ Zhang XT, Tang HP, Sun YT, et al. Elucidating the effects of arginine and lysine on a monoclonal antibody C-terminal lysine variation in CHO cell cultures［J］. Appl Microbiol Biotechnol,2015, 99（16）：6643-6652.

［15］ Guile GR, Rudd PM, Wing DR, et al. A rapid high-resolution high-performance liquid chromatographic method for separating glycan mixtures and analyzing oligosaccharide profiles［J］. Anal Biochem, 1996, 240（2）：210-226.

［16］ 陳以衡, 陶姝宇, 劉旭平. 微載體濃度與細(xì)胞接種密度對(duì)ST細(xì)胞生長的影響［J］. 生物技術(shù)通報(bào), 2016, 32（4）：242-250.

［17］ Le H, Kabbur S, Pollastrini L, et al. Multivariate analysis of cell culture bioprocess data-lactate consumption as process indicator［J］. J Biotechnol, 2012, 162（2-3）：210-223.

［18］ Chen F, Ye Z, Zhao L, et al. Correlation of antibody production rate with glucose and lactate metabolism in Chinese hamster ovary cells［J］. Biotechnol Lett, 2012, 34（3）：425-432.

［19］ Edwards LJ. Carbon dioxide anaesthesia and succinic dehydrogenase in the corn earworm, Heliothis zea［J］. J Insect Physiol, 1968, 14（8）：1045-1048.

［20］ Friedlander A, Navarro S, Silhacek DL. The effect of carbon dioxide on NADPH production inEphestia cautella（Wlk. ）pupae［J］.Comp Biochem Phys B, 1984, 77（4）：839-842.

［21］ Martínez VS, Dietmair S, Quek LE, et al. Flux balance analysis of CHO cells before and after a metabolic switch from lactate production to consumption［J］. Biotechnol Bioeng, 2013, 110（2）：660-666.

［22］ Shen D, Kiehl TR, Khattak SF, et al. Transcriptomic responses to sodium chloride-induced osmotic stress：A study of industrial fedbatch CHO cell cultures［J］. Biotechnol Progr, 2010, 26（4）：1104-1115.

［23］ Rathore AS. Roadmap for implementation of quality by design（QbD）for biotechnology products［J］. Trends Biotechnol, 2009,27（9）：546-553.