趙淑飛 許光輝　黃亦琦　戚歡陽 馬雪云 潘東明

糖尿病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，當前全球范圍內糖尿病患者已高達3.87億，預計這一數(shù)字到2030年會超過5億?，F(xiàn)在我國的糖尿病絕對患病人數(shù)居世界首位，糖尿病已經成為繼腫瘤、心腦血管病之后對人類健康構成嚴重危害的第三大疾病，闡明糖尿病發(fā)病機制、開發(fā)安全有效的治療藥物刻不容緩。研究表明[1-2]2型糖尿病患者胰島β細胞凋亡增高，胰島素分泌功能下降。因此，保護胰島β細胞分泌功能，減緩細胞凋亡，是抗糖尿病的關鍵，也是尋找抗糖尿病有效藥物的基礎。

家蠶治療消渴病歷史悠久，在傳統(tǒng)中藥的記載中關于家蠶治療消渴病的介紹，如《齊民要術》 《天工開物》 《神農本草》 《中國藥物》等對家蠶的藥用價值均有記載，主要用于治療小兒疳熱、消瘦、消渴。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)[4-6]全蠶粉抑制血糖值的主要有效成分是1-脫氧野尻霉素和黃酮類化合物。全蠶粉[7]中含有三碘甲腺原氨酸（T3），蠶沙中果膠，以及全蠶粉中的蛋白質多肽、甾族激素、蠶素、蛻皮激素等物質[5，8]，可能具有不同程度調節(jié)血糖的作用。本實驗中用家蠶醇提物（Silkworm alcohol Extract，SA） 作用于胰島β細胞，旨在研究其對胰島β細胞增殖、凋亡的影響。

1　材料

1.1藥品與試劑 DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司）；胎牛血清（Bi公司）；CCK-8試劑盒（Keygentech公司）；PI熒光染色試劑盒（Keygentech公司）。

1.2細胞株 小鼠胰島β細胞瘤MIN6細胞，采用DMEM高糖培養(yǎng)基，臨用前加青鏈霉素混合液、10%FBS。在37 °C，5%CO2條件下培養(yǎng)。

2　方法

2.1SA的制備 采集5齡3天家蠶，凍干粉碎，70%乙醇提取，得到乙醇部位，與培養(yǎng)基配制成0.66 g/mL的混懸液，0.22 um水系濾膜過濾，備用。

2.2CCK-8法檢測SA對正常細胞增殖活性 取對數(shù)生長期的MIN6細胞，調整濃度為4×104，接種至96孔板中，加入細胞培養(yǎng)液以100μL/孔。培養(yǎng)24h細胞貼壁匯合，棄培養(yǎng)基，用細胞培養(yǎng)基稀釋SA，以每孔100μL的量加入細胞，終濃度設為0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL，每孔至少設3個重復孔，同時以不含SA的細胞作為空白對照組，培養(yǎng)12 h，每孔10μL的CCK-8溶液，37°C培養(yǎng)箱孵育4 h，酶標儀檢測OD值，波長為450 nm。實驗重復3次。

2.3H2O2誘導MIN6細胞損傷模型實驗方法同2.2，MIN6細胞培養(yǎng)24 h貼壁后，H2O2終濃度設為0、220、440、660、880μmol/L，至少設3個重復孔，培養(yǎng)12 h，按CCK-8試劑盒操作方法測OD值，計算細胞存活率。實驗重復3次。

2.4CCK-8法檢測SA對H2O2損傷細胞的作用 實驗方法同2.2，MIN6細胞加家蠶醇提物預培養(yǎng)12 h，設5個分組：空白組、模型組、440μmol/L H2O2+0.25 mg/mL SA組、440μmol/L H2O2+0.5 mg/mL SA組、440μmol/L H2O2+1 mg/mL SA組。至少設3個重復孔，培養(yǎng)12 h，按CCK-8試劑盒操作方法測OD值。實驗重復3次。

2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡 取生長狀態(tài)好的MIN6細胞，按照常規(guī)傳代方法制成單細胞懸液接種于10 cm2培養(yǎng)皿，約1×105/mL，每瓶加DMEM完全培養(yǎng)液10 mL，培養(yǎng)24 h細胞貼壁后，棄原培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（PBS） 洗2次，培養(yǎng)基稀釋成2.2所示的濃度，培養(yǎng)細胞24 h，同時設空白對照組；細胞密度106/mL，用0.02%胰酶進行常規(guī)消化2 min，含血清的培養(yǎng)液終止消化，吹打均勻，細胞懸液離心（5 min、800 rpm），棄上清，加7 mL PBS重懸細胞，制成單細胞懸液，離心；棄上清，加70%乙醇固定，與4°C冰箱過夜。棄去乙醇，加PBS至1 mL，離心；加入PBS 300μL重懸細胞沉淀，加入RNaseA（終濃度20 ug/mL） 0.6μL，37°C作用30 min；向300μL細胞懸液中，加入PI（1 mg/mL）10μL，置于4°C冰箱，避光染色30 min，即可上機檢測。2.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，結果采用均數(shù)±標準差（x±s）表示。對于各組之間的差異采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3　結果

3.1SA對正常MIN6細胞的作用 用CCK-8法檢測SA對MIN6細胞增殖活性的影響，結果如表1所示。不同濃度SA作用于MIN6細胞12 h，與對照組相比，0.5 mg/mL和1 mg/mL SA組MIN6細胞活性升高，且呈濃度依賴性（P<0.05）。

表1　不同濃度SA作用后胰島MIN6細胞的增殖活性?。▁±s）

3.2H2O2誘導MIN6細胞損傷模型 不同濃度H2O2誘導MIN6細胞損傷結果如表2所示。不同濃度H2O2作用于MIN6細胞12 h后，對細胞造成不同程度的損傷。濃度為440μmol/L H2O2培養(yǎng)細胞12 h后，計算細胞存活率（給藥組/空白組×100%），存活率為60%（P<0.05），為最佳造模濃度。

表2　不同濃度H2O2誘導MIN6細胞損傷?。▁±s）

3.3SA對H2O2損傷MIN6細胞的作用 SA對H2O2損傷MIN6細胞的作用，結果如表3所示。不同濃度SA+440μmol/L H2O2作用于MIN6細胞12 h后，440μmol/LH2O2+0.5 mg/mL SA組和440μmol/L H2O2+1 mg/mL SA組與模型組相比對MIN6細胞有保護作用（P<0.05）。0.25 mg/mL+H2O2SA組與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義。

表3　不同濃度SA對H2O2損傷MIN6細胞的保護作用 （x±s）

3.4SA對MIN6細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測細胞凋亡結果顯示，與對照組比較，0.5 mg/mL和1 mg/mL SA組MIN6細胞凋亡率呈減少趨勢（P<0.05）；0.25 mg/mLSA組與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義。結果見表4。

表4　不同濃度SA作用后胰島MIN6細胞的凋亡率?。▁±s）

4　討論

胰島β細胞在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起著十分重要的作用[9]，胰島β細胞功能損害是糖尿病的主要病理機制之一。盡管胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病的始動因素，但β細胞功能受損是2型糖尿病的決定因素[10]。本實驗用不同濃度的SA（0、0.25、0.5、1 mg/mL） 干預胰島 MIN6細胞12 h，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，0.5 mg/mL和1 mg/mL SA組MIN6細胞增殖活性增高（P<0.05），細胞凋亡率減低（P<0.05），且呈劑量依賴性；440μmol/L H2O2誘導MIN 6細胞損傷12 h，細胞存活率為60%，為最佳造模濃度。0.5 mg/mL和1 mg/mL SA對H2O2誘導MIN 6細胞損傷有保護作用。

本實驗結果提示適宜劑量的SA可以通過促進胰島β細胞增殖，抑制其凋亡，進而改善胰島β細胞功能，對糖尿病的防治有積極作用；此實驗探討了SA對胰島β細胞的影響，其機制正在進一步研究中，考慮與AKT及其下游信號傳導通路有關。因此，進一步探討SA的作用機制及臨床療效，對中西醫(yī)聯(lián)合治療糖尿病有著重要意義。

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