徐　丹， 郭　芮， 易建華， 寧建琴， 朱振寶

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安　710021)

0　引言

油脂氧化是導(dǎo)致食品腐敗，改變產(chǎn)品風(fēng)味、質(zhì)地和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，以及縮短油料食品貨架期的主要因素之一[1].O/W乳液，例如牛奶，嬰幼兒配方奶粉，沙拉醬等是食品中最常見(jiàn)的油脂存在形式之一.油脂氧化大多發(fā)生在油水交界面，研究表明，界面脂溶性和水溶性組分相互作用較為強(qiáng)烈，從而能夠加速油脂氧化.

WPI和CS是乳蛋白的兩種主要組分.乳蛋白具有乳化特性，能夠吸附在油-水界面，降低乳滴界面張力提高乳液物理穩(wěn)定性，因此，作為大分子乳化劑常應(yīng)用于制備食品乳液體系[2].與此同時(shí)，蛋白質(zhì)是一種天然抗氧化劑.已有研究表明，吸附于油-水界面的膜蛋白以及溶解于連續(xù)相的水相蛋白都能抑制油脂氧化[3].蛋白質(zhì)的抗氧化活性可能機(jī)理：螯合促氧化過(guò)渡金屬離子，通過(guò)氨基酸清除自由基，在界面形成粘彈性的薄膜抑制油脂與促氧化劑的相互作用[4,5].目前，已有許多乳液氧化穩(wěn)定性的相關(guān)研究，如Hairan M等[6]研究表明，改性的CS可以提高亞麻籽油乳液的氧化穩(wěn)定性；Phoon等[7]研究表明，經(jīng)熱處理的β-乳球蛋白影響水包鯡魚油乳液中油脂的氧化，揭示了當(dāng)β-乳球蛋白被加熱至熔融狀態(tài)時(shí)，它可以提高油脂氧化穩(wěn)定性；Mei等[8]研究表明，酚醛類抗氧化劑增加鐵離子的促氧化活性，在較低pH下加速油脂氧化.以上研究多數(shù)集中于經(jīng)過(guò)預(yù)處理的WPI、CS或非蛋白類抗氧化劑對(duì)乳液氧化穩(wěn)定性的影響.基于此，本文研究未經(jīng)處理的WPI和CS，比較在水包核桃油乳液體系中不同因素對(duì)其抗氧化活性的影響.

既往研究表明，O/W乳液氧化穩(wěn)定性受多種因素影響，水相環(huán)境(如水相pH、離子強(qiáng)度、乳化劑種類及濃度)以及界面特性(如界面厚度、帶電特性等).本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖潜容^研究WPI與CS及其濃度，pH，鹽濃度對(duì)水包核桃油乳液中油脂氧化的影響，為乳蛋白同時(shí)作為乳化劑以及抗氧化劑應(yīng)用于食品乳液提供理論與技術(shù)支持.

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1主要材料與試劑

乳清分離蛋白：Davisc WPI95，純度為96.5%，酪蛋白(Casein)：純度為85.7%，上海福諾食品有限公司；磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，疊氮鈉，石油醚，異辛烷，異丙醇，正丁醇，甲醇，分析純，天津科密歐試劑有限公司；三氯乙酸，硫代巴比妥酸，硫氰酸銨，分析純，天津天力試劑有限公司；氫過(guò)氧化枯烯，1,1,3,3-四乙氧基丙烷，分析純，阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；核桃油，實(shí)驗(yàn)室提取[9].

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器

精密pH計(jì)，PB-10型，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠；電子天平，BS323S型，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；磁力攪拌器，84-1型，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；超細(xì)勻漿器，F(xiàn)6/10-10G型，上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；超高壓均質(zhì)機(jī)，HP-4L科研型，喜高精密流體機(jī)械有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，GZX-GF101-1-BS型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，DF-101S型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；漩渦混合器，QL-901型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；離心機(jī)，D-16C型，賽多利斯實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，UV759S型，上海荊和分析儀器有限公司.

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1O/W乳液的制備

參考文獻(xiàn)[10]的方法，略有改動(dòng).將WPI和CS溶解于10 mmol/L pH 3.0或7.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(用去離子水溶解)中，加入0.02%疊氮鈉防腐.室溫下磁力攪拌2 h，放入4 ℃冰箱中冷藏過(guò)夜.乳液的制備分為兩個(gè)階段，首先，將5%的核桃油(油相)與95%的含乳化劑的緩沖液(水相)通過(guò)手持式超細(xì)勻漿器攪拌混合形成粗乳，攪拌速率為10 000 r/min，攪拌時(shí)間為1 min.然后用高壓均質(zhì)機(jī)，在50 MPa均質(zhì)3次，得到乳化均勻的乳狀液.

1.2.2油脂氫過(guò)氧化物(ROOH)含量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[3,11]的方法，稍有改動(dòng).將乳液置于具塞試管中于50 ℃烘箱中氧化12 d，每天測(cè)定油脂ROOH濃度.取0.3 mL樣品，與1.5 mL異辛醇/異丙醇(3∶1，v/v)混合液混合，用混合振蕩器振蕩3次，每次10 s.1000 r/min離心2 min，取200μL上層有機(jī)相溶液與2.8 mL甲醇/1-丁醇(2∶1，v/v)混合液混合，再加入50μL 3.94 mol/L硫氰酸銨溶液和50μL亞鐵離子溶液(由0.132 mol/L氯化鋇溶液和0.144 mol/L硫酸亞鐵溶液按照體積比為1∶1混合而成)，振蕩混合20 min，在510 nm下測(cè)吸光度.以氫過(guò)氧化枯烯為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.2.3硫代巴比妥酸結(jié)合物(TBARS)含量的測(cè)定

乳液中TBARS含量根據(jù)文獻(xiàn)[3,12]方法測(cè)定.經(jīng)12 d存放后，測(cè)定乳液中次級(jí)氧化產(chǎn)物TBARS的含量.

配制TCA-TBA-HCl(三氯乙酸-硫代巴比妥酸-HCl)混合溶液：15%(w/v)TCA、0.375%(w/v)TBA和0.25 mol/L鹽酸溶液；2%BHA(丁基羥基茴香醚)乙醇溶液；TBA混合試劑：以100∶3的比例混合TCA-TBA-HCl溶液和BHA乙醇溶液.

取2 mL TBA混合試劑于試管中，加入1 mL樣品，混合后，95 ℃水浴加熱15 min，然后室溫水浴冷卻10 min，8 000 r/min離心20 min，靜置10 min后于532 nm條件下測(cè)定吸光值.以1,1,3,3-四乙氧基丙烷為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.2.4不同蛋白質(zhì)及其濃度對(duì)乳液氧化穩(wěn)定性的影響

分別將1.0、1.5、2.0 wt% WPI和CS溶于pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液中作為水相，根據(jù)1.2.1制備WPI和CS穩(wěn)定的水包核桃油乳液.分別將乳液在50 ℃強(qiáng)制氧化12 d，根據(jù)1.2.2和1.2.3，每天測(cè)定其ROOH和TBARS含量，研究?jī)煞N蛋白質(zhì)及其濃度對(duì)水包核桃油乳液氧化穩(wěn)定性的影響.

1.2.5不同pH對(duì)乳液氧化穩(wěn)定性的影響

分別將2.0 wt% WPI和CS溶于pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，用0.1 mol/L HCl溶液或NaOH溶液調(diào)節(jié)體系的不同pH，分別為3.0、7.0、8.0、9.0，參照1.2.1方法，制備一系列乳液后，同1.2.4每天測(cè)其ROOH和TBARS含量，研究pH對(duì)乳液中油脂氧化穩(wěn)定性的影響.

1.2.6不同濃度NaCl對(duì)乳液氧化穩(wěn)定性的影響

分別將1.5 wt% WPI和CS分別溶于pH 7.0磷酸鹽緩沖液中，根據(jù)上文研究的物理穩(wěn)態(tài)下的鈉鹽濃度，磁力攪拌條件下，緩緩加入濃度為0、50和100 mmol/L NaCl，制備一系列乳液，同1.2.4，每天測(cè)其ROOH和TBARS含量，研究NaCl對(duì)乳液氧化穩(wěn)定性的影響.

2　結(jié)果與討論

2.1WPI與CS及其濃度對(duì)乳液油脂氧化穩(wěn)定性的影響

不同濃度WPI和CS穩(wěn)定的水包核桃油乳液中油脂的氧化速率如圖1所示.從圖1可看出，隨著WPI和CS濃度的增加，乳液中油脂氧化的初級(jí)產(chǎn)物ROOH和次級(jí)氧化產(chǎn)物TBARS濃度均出現(xiàn)降低的趨勢(shì).乳液存放7 d，1.0 wt% WPI乳液ROOH濃度逐漸增大直至最大值(0.615±0.018 mmol/L 乳液)，然后逐漸降低，其原因在于ROOH分解為次級(jí)氧化產(chǎn)物如丙二醛、丙醛、己醛等小分子[11].1.5、2.0 wt% WPI 乳液形成最高ROOH濃度的時(shí)間延遲至8 d，且形成的ROOH濃度低于1.0 wt%WPI穩(wěn)定的乳液，表明提高WPI濃度有利于抑制乳液油脂氧化，這與Kellerby等[13]的研究結(jié)果一致.有研究表明，蛋白質(zhì)濃度越大，更有效的蛋白質(zhì)吸附導(dǎo)致更厚界面層的形成，因此提供更好的界面屏障阻止促氧化劑的攻擊[14].還有研究表明，當(dāng)油滴被蛋白質(zhì)完全覆蓋后，蛋白質(zhì)主要以游離形式存在于水相，水相蛋白可以通過(guò)螯合金屬離子與清除自由基等途徑抑制油脂氧化.故而蛋白質(zhì)濃度越大，乳液氧化穩(wěn)定性越高[15].

比較圖1(a)和圖1(b)的研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，同濃度下，CS穩(wěn)定的乳液形成的最高ROOH濃度(如1% CS，ROOH為0.666±0.022 mmol/L乳液)高于WPI乳液(如1% WPI，ROOH為0.615±0.018 mmol/L乳液).有研究[16]顯示，CS是一種有彈性的生物聚合物，可以形成相對(duì)較厚的界面膜，能夠在連續(xù)相促氧化劑(如過(guò)渡金屬離子)和油脂之間形成更堅(jiān)實(shí)的物理屏障，因此其乳液的氧化穩(wěn)定性較WPI乳液更好.本文的研究結(jié)果與其不一致，分析可能的原因在于本實(shí)驗(yàn)所用的蛋白質(zhì)純度不同.本實(shí)驗(yàn)材料未經(jīng)純化處理，CS純度(85.7%)低于WPI純度(96.5%).

(a)WPI濃度對(duì)ROOH形成的影響

(b)CS濃度對(duì)ROOH形成的影響

(c)WPI濃度對(duì)TBARS形成的影響

(d)CS濃度對(duì)TBARS形成的影響圖1　不同蛋白質(zhì)及其濃度對(duì)乳液油脂氧化穩(wěn)定性的影響

2.2　水相pH對(duì)乳液油脂氧化穩(wěn)定性的影響

不同水相pH對(duì)乳液中油脂氧化的影響如圖2所示.由圖2可看出，隨著pH升高，WPI和CS穩(wěn)定的水包核桃油乳液中油脂ROOH和TBARS含量也逐漸增大.pH分別為3.0和9.0，乳液存放7 d后，WPI乳液中油脂ROOH濃度分別為0.575±0.012、0.824±0.013 mmol/L 乳液(圖2(a))；存放12 d后，TBARS濃度分別為9.298±0.539、16.330±0.642μmol/L 乳液(圖2(c)).由以上結(jié)果均可發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH低于WPI等電點(diǎn)(pI=4.8)時(shí)，乳滴帶正電荷，乳液的氧化穩(wěn)定性更高，其原因可能是由于帶正電的乳滴排斥促氧化過(guò)渡金屬離子，從而抑制油脂的氧化.Mancuso等[17]以Tween20制備O/W乳液，研究發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)論：pH 7.0時(shí)油脂氧化速率高于pH 3.0.

不同pH對(duì)CS乳液氧化穩(wěn)定性的影響與WPI乳液基本一致.然而，比較圖2(a)與2(b)以及圖2(c)與2(d)，在相同pH時(shí)，WPI乳液的氧化穩(wěn)定性略高于CS乳液.

(a)pH對(duì)WPI乳液ROOH形成的影響

(b)pH對(duì)CS乳液ROOH形成的影響

(c)pH對(duì)WPI乳液TBARS形成的影響

(d)pH對(duì)CS乳液TBARS形成的影響圖2　不同 pH對(duì)乳液油脂氧化穩(wěn)定性的影響

2.3　NaCl對(duì)乳液氧化穩(wěn)定性的影響

己有研究[16]表明，pH會(huì)影響乳滴的帶電性，而電荷的差異會(huì)對(duì)乳液的氧化穩(wěn)定性產(chǎn)生一定影響.圖3為pH 7.0 NaCl對(duì)WPI和CS乳液氧化穩(wěn)定性的影響結(jié)果.

從圖3可以看出，隨著NaCl濃度的增大，WPI和CS乳液油脂ROOH濃度均表現(xiàn)為先減小后增大的趨勢(shì)(圖3(a)、3(b)).NaCl濃度為50 mmol/L時(shí)，一定程度地提高了乳液中油脂的氧化穩(wěn)定性，由此可見(jiàn)，低濃度NaCl可以提高WPI和CS在乳液中的抗氧化活性；然而，NaCl濃度增加到100 mmol/L時(shí)，油脂ROOH增大，顯示較高離子濃度抑制了WPI和CS在乳液中的抗氧化活性.次級(jí)氧化產(chǎn)物TBARS濃度的變化趨勢(shì)和ROOH濃度一致(圖3(c)、3(d)).Wit等[18]的研究表明，高鹽濃度使乳滴負(fù)電荷的量減少，電荷屏蔽效應(yīng)可能減弱蛋白質(zhì)螯合金屬離子的能力，因此導(dǎo)致抗氧化能力的減弱.從兩種蛋白乳液油脂氧化的結(jié)果還可以看出，WPI乳液中油脂氧化穩(wěn)定性較CS乳液略好，但不存在明顯的差異.

(a)NaCl對(duì)WPI乳液ROOH形成的影響

(b)NaCl對(duì)CS乳液ROOH形成的影響

(c)NaCl對(duì)WPI乳液TBARS形成的影響

(d)NaCl對(duì)CS乳液TBARS形成的影響圖3　NaCl對(duì)乳液油脂氧化穩(wěn)定性的影響(pH 7.0)

3　結(jié)論

分別以WPI和CS兩種蛋白質(zhì)為乳化劑制備水包核桃油乳液，研究不同因素對(duì)體系油脂氧化穩(wěn)定性的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著WPI和CS濃度的增加，乳液氧化穩(wěn)定性均有不同程度的提高.水相pH對(duì)油脂的氧化穩(wěn)定性影響較大，pH低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pI時(shí)，油脂氧化穩(wěn)定性較高；pH高于pI時(shí)，油脂氧化穩(wěn)定性較低.NaCl對(duì)水包核桃油乳液氧化穩(wěn)定性有不同程度影響，低NaCl濃度可以提高WPI和CS在乳液中的抗氧化活性，高NaCl濃度抑制WPI和CS的抗氧化性.WPI乳液油脂的氧化穩(wěn)定性高于CS乳液.

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