吳雨豪，劉文娟，武燕華，周耀鋒，熊勇華

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047； 2.江西中德生物工程有限公司，江西 南昌 330029)

沙丁胺醇(salbutamol，SAL)是一種人工合成的腎上β受體激動劑，可加速動物生長、改善脂肪型動物肉與脂肪的比例[1-3]，因此常被用作鹽酸克倫特羅的替代品添加于動物飼料中[4-6]。沙丁胺醇在動物體內(nèi)的殘留具有與鹽酸克倫特羅相同的危害性[7-9]。人食用含有沙丁胺醇的動物組織后會出現(xiàn)肌肉顫動、肌痛、頭痛甚至惡心及嘔吐等中毒癥狀[10-13]。目前，世界上許多國家禁止使用沙丁胺醇作為飼料添加劑，并且建立了嚴(yán)格的飼料和家畜尿、血和肝中沙丁胺醇監(jiān)控方法[14-15]。

沙丁胺醇常用的檢測方法包括儀器確證法以及免疫學(xué)篩查法兩大類[16]，儀器法因需借助昂貴的儀器設(shè)備以及熟練的操作人員，因此在基層單位的使用受到極大的限制[17]，而以膠體金為標(biāo)記探針的免疫層析試紙條方法因具有檢測速度快、操作簡單、價格便宜及適合現(xiàn)場檢測等優(yōu)勢，在基層單位得到了廣泛推廣和應(yīng)用[18]。但是現(xiàn)有的膠體金免疫層析試紙條檢測沙丁胺醇的靈敏度通常介于3～5 ng/mL，且無法實(shí)現(xiàn)定量檢測，因此無法滿足國家限量標(biāo)準(zhǔn)的要求[19]。提高標(biāo)記探針的檢測靈敏度是提高免疫層析方法檢測靈敏度的一種常用手段，現(xiàn)有膠體金免疫層析試紙條通常采用20～40 nm球狀膠體金為顯色探針[20]。多枝狀的膠體金(金納米花)由于表面等離子體共振效應(yīng)，在相同的粒徑下具有比球形膠體金更高的摩爾消光系數(shù)[21]；同時，本實(shí)驗(yàn)室成員前期研究發(fā)現(xiàn)大粒徑膠體金可有效地提高競爭免疫層析方法的檢測靈敏度[22]。

因此，本實(shí)驗(yàn)中，筆者采用種子生長法合成了粒徑為65 nm的多枝狀膠體金(金納米花，AuNFs)，并以此為新型探針來建立檢測豬尿樣中沙丁胺醇的免疫層析試紙條新方法，以期達(dá)到快速、定量檢測沙丁胺醇的目的。

1　材料與方法

1.1　儀器與試劑

XYZ3000型點(diǎn)膜儀、自動切條儀，金標(biāo)生物科技公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、紫外可見光分光光度計，上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；JEOL JEM 2100型高分辨率透射電鏡，日本電子株式會社。

硝酸纖維素膜(NC膜)、樣品墊、吸水紙及PVC底板，美國Millipore公司；金標(biāo)探針復(fù)溶液、SAL標(biāo)準(zhǔn)品、鼠抗SAL單克隆抗體、BSA-SAL檢測抗原、羊抗鼠二抗、沙丁胺醇ELISA試劑盒，中德無錫伯爾生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白、PEG20000、檸檬酸三鈉、對苯二酚、氯金酸，Sigma公司。

1.2　膠體金種子溶液的制備

金種子的合成參照文獻(xiàn)[23]報道的方法實(shí)施。將100 mL氯金酸溶液(0.1 mg/mL)加熱至沸騰，在快速攪拌的條件下迅速加入2.7 mL檸檬酸三鈉溶液(10 mg/mL)，繼續(xù)加熱攪拌10 min后，室溫下冷卻即可獲得酒紅色的金種子溶液。

1.3　AuNFs的合成

AuNFs采用對苯二酚還原法合成[24]，具體步驟如下：將100 mL超純水加熱至50 ℃，然后依次加入2.67 mL金種子溶液，1.2 mL氯金酸溶液(10 mg/mL)以及2.64 mL檸檬酸三鈉溶液(10 mg/mL)，溫度維持在50 ℃，然后迅速加入24 mL對苯二酚緩沖液(30 mmol/L)，溶液攪拌冷卻至室溫。4 000g離心AuNFs溶液15 min，棄上清，沉淀重懸于100 mL檸檬酸三鈉(0.2 mg/mL)溶液，并置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4　AuNFs探針(AuNF-Abs)的制備

取5 mL AuNFs溶液于潔凈小燒杯中，置于磁力攪拌器緩慢勻速攪拌，0.1 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)溶液pH至6.5，加入鼠抗SAL單克隆抗體，室溫攪拌反應(yīng)60 min后加入500 μL PEG20000溶液(10 mg/mL)反應(yīng)30 min，然后加入500 μL BSA溶液(100 mg/mL)繼續(xù)反應(yīng)30 min。標(biāo)記了抗體的AuNFs探針，5 000g離心15 min，沉淀用1 mL復(fù)溶液重懸，4 ℃保存待用。

1.5　制備AuNFs試紙條及試紙條免疫動力學(xué)分析

將BSA-SAL檢測抗原(0.8 mg/mL)和羊抗鼠二抗(1.5 mg/mL)分別噴涂于NC膜上為試紙條檢測線(T線)與質(zhì)控線(C線)，并置于37 ℃恒溫干燥12 h。將預(yù)處理好的NC膜、樣品墊以及吸水紙依次整齊粘貼在PVC底板上，切成4 mm寬的試紙條，裝入自封袋，并放置于干燥箱中保存待用。將含SAL質(zhì)量濃度分別為0、0.125、0.25以及0.5 ng/mL 的豬尿樣品98 μL與2 μL AuNF-Abs孵育5 min，然后分別加至試紙條加樣孔，膠體金讀卡儀每隔30 s讀取試紙條T/C比值(T線與C線熒光強(qiáng)度比值)，連續(xù)監(jiān)控25 min，每個濃度重復(fù)3 次試驗(yàn)。以反應(yīng)時間為橫坐標(biāo)，T/C比值為縱坐標(biāo)繪制試紙條免疫動力學(xué)曲線，確定試紙條定量檢測的最佳時間。

1.6　定量檢測SAL的標(biāo)準(zhǔn)曲線

將SAL標(biāo)準(zhǔn)品分別添加至經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)方法確定為SAL陰性的豬尿樣品中，配制SAL質(zhì)量濃度為0～3 ng/mL的SAL標(biāo)準(zhǔn)溶液。取以上SAL標(biāo)準(zhǔn)溶液98 μL與2 μL AuNFs探針混合孵育5 min，加入試紙條點(diǎn)樣孔，室溫反應(yīng)12 min。膠體金試紙條讀取儀讀取試紙條T/C比值，每個標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)檢測3次。當(dāng)SAL濃度為0時，試紙條T/C比值定義為B0，以SAL濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，(B/B0)×100為縱坐標(biāo)，繪制檢測豬尿中SAL含量的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7　AuNFs免疫層析試紙條性能評價

AuNFs免疫層析試紙條檢測SAL的特異性評價方法如下：將加標(biāo)克倫特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、班布特羅、妥布特羅、溴布特羅、噴布特羅、特布他林以及馬布特羅的豬尿樣品(1 ng/mL)，SAL陰性以及陽性(0.5 ng/mL)豬尿樣品加至試紙條加樣孔，讀取儀讀取試紙條T/C比值以評價AuNFs免疫層析試紙條與以上9種SAL結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率。

AuNFs試紙條檢測豬尿中SAL的準(zhǔn)確性以及精密度通過批內(nèi)以及批間加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評價，具體方案如下：取SAL陰性豬尿樣品,分別添加SAL至終質(zhì)量濃度為0.05、0.15以及0.5 ng/mL，每個樣品重復(fù)檢測5次，計算SAL加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，以評價試紙條的批內(nèi)穩(wěn)定性；隨后每隔5 d連續(xù)檢測3次，計算加標(biāo)樣品的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差以評價試紙條的批間穩(wěn)定性。

2　結(jié)果與討論

2.1　AuNFs的表征

采用金種子生長法合成獲得了藍(lán)色的AuNFs溶液。考察AuNFs形態(tài)以及AuNF-Abs紫外吸收圖譜，結(jié)果見圖1～2。由圖1～2可知：金納米顆粒表面形貌呈現(xiàn)明顯的多枝狀分布，但顆粒的粒徑分布均勻，平均粒徑為65 nm。動態(tài)光散射結(jié)果顯示AuNFs平均水化粒徑為68 nm。紫外可見光光譜分析表明AuNFs溶液等離子共振的最大吸收峰為612 nm，而AuNF-Abs等離子共振吸收峰紅移至620 nm(圖1)，表明抗體成功地標(biāo)記至AuNFs表面。

圖1　　　　AuNFs以及AuNF-Abs紫外吸收圖譜Fig.1　　　　UV-vis spectra of AuNFs and AuNF-Abs

圖2　　　　AuNFs透射電鏡Fig.2　　　　TEM image of AuNFs

2.2　AuNFs免疫層析試紙條定量檢測SAL的原理

A為陽性，B為陰性圖3　　　　AuNFs免疫層析試紙條定量檢測SAL的原理Fig.3　　　　Schematic diagram of AuNFs-based strip for SAL detection

圖3為AuNFs試紙條定量檢測SAL的原理圖。由圖3可知：當(dāng)樣品中不含SAL時，AuNFs-Abs泳動至NC膜T線區(qū)域，AuNFs表面結(jié)合抗體與T線抗原結(jié)合，未被結(jié)合的AuNFs探針進(jìn)一步被C線的二抗捕獲，試紙條T、C線分別顯示藍(lán)色條帶；當(dāng)樣品中含有SAL時，標(biāo)記在AuNFs表面的抗SAL單克隆抗體首先與樣品溶液中SAL特異性結(jié)合形成免疫復(fù)合物，從而抑制了AuNFs探針與T線抗原結(jié)合，T線顏色變?nèi)?，未被T線捕獲的AuNFs-Abs被C線區(qū)域二抗捕獲，C線顏色增強(qiáng)，此時試紙條T/C比值與溶液SAL濃度對數(shù)呈反比。若試紙條C線不顯色，表明試紙條失效。

2.3　AuNFs最佳標(biāo)記pH的優(yōu)化

膠體金溶液的pH極大地影響著抗體標(biāo)記效率以及抗體活性。為了獲得最佳標(biāo)記效率以及金標(biāo)探針最佳活性，用0.1 mol/L的K2CO3分別將AuNFs溶液pH調(diào)節(jié)至6.0、6.5、7.0、7.5以及8.0，然后加入抗體制備AuNF-Abs探針。將獲得的AuNF-Abs與陰性豬尿樣品混合，試紙條檢測AuNF-Abs。通過讀取儀記錄試紙條T、C線吸光值以及T/C比值評價抗體偶聯(lián)過程中溶液pH對抗體偶聯(lián)效率的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知：當(dāng)溶液pH為6.5時，試紙條T線顯色最強(qiáng)，T/C比值亦最高，因此，抗體標(biāo)記AuNFs的最佳pH為6.5。

圖4　　　　溶液pH對抗體標(biāo)記效率的影響Fig.4　　　　Effects of solution pH on labeling efficiency of antibodies on the surface of AuNFs

2.4　優(yōu)化AuNFs試紙條制備工藝

在試紙條制備過程中，抗體標(biāo)記數(shù)量、AuNF-Abs用量以及T線噴涂BSA-SAL濃度是影響試紙條檢測靈敏度的主要因素。為了獲得檢測SAL最高靈敏度，采用“三因素三水平”正交試驗(yàn)對以上三因素進(jìn)行了優(yōu)化，其中試紙條C線二抗噴涂質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL，結(jié)果見表1。由表1可知：當(dāng)T線噴涂BSA-SAL偶聯(lián)物質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL、抗體標(biāo)記質(zhì)量濃度為2 μg/mL、AuNF-Abs用量0.75 μL時，試紙條檢測SAL(0.25 ng/mL)加標(biāo)尿樣，競爭抑制率最高(76.02%)，但該條件下試紙條檢測SAL陰性尿樣T線顯色偏弱，吸光值僅為248.6；而當(dāng)T線噴涂BSA-SAL偶聯(lián)物質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL、抗體標(biāo)記質(zhì)量濃度為1.25 μg/mL、AuNF-Abs用量2 μL時(第8組)，試紙條T、C線顯示明顯的藍(lán)色條帶，吸光值分別達(dá)到482.7及418.4，競爭抑制率亦達(dá)到73.13%，因此選擇該條件為最佳實(shí)驗(yàn)條件。

2.5　確定AuNFs試紙條定量檢測SAL的判讀時間

免疫層析試紙條T、C線的顏色累積是抗原、抗體免疫動力學(xué)反應(yīng)的結(jié)果。試紙條T線顯色深淺不僅與待測物濃度有關(guān)，而且與檢測環(huán)境溫度、試紙條的加工差異以及樣品基質(zhì)效應(yīng)等均有關(guān)，而T/C比值法可有效地消除以上內(nèi)在因素的干擾，減少試紙條定量檢測誤差率。為了獲得試紙條定量分析最佳時間，本實(shí)驗(yàn)記錄了不同SAL檢測濃度下，試紙條T/C比值與免疫反應(yīng)時間的動力學(xué)變化過程，以T/C比值達(dá)到穩(wěn)定的時間確認(rèn)為試紙條最佳判定時間，結(jié)果見圖5。由圖5可知：當(dāng)樣品中SAL濃度為0時，試紙條T/C比值在加樣后12 min趨于穩(wěn)定；而當(dāng)樣品中含有SAL時，試紙條T/C比值在5 min之內(nèi)即可趨于穩(wěn)定，因此AuNFs試紙條檢測SAL的最佳定量時間確定為加樣后12 min。

表1　正交試驗(yàn)優(yōu)化T線BSA-SAL全抗原濃度、AuNFs探針用量及AuNFs抗體標(biāo)記濃度

注：*競爭抑制率是基于0.25 ng/mL陽性添加實(shí)驗(yàn)所得。

圖5　　　　AuNFs試紙條檢測SAL的T/C免疫動力學(xué)曲線Fig.5　　　　Kinetic reaction curves of T/C ratio against immunoreaction time based on AuNF-based strip for SAL detection

2.6　定量檢測SAL的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6為AuNFs免疫層析試紙條檢測豬尿中SAL的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖6可看出，隨著豬尿中SAL濃度的增高，試紙條B/B0值逐漸降低。當(dāng)SAL質(zhì)量濃度在0.05～1.0 ng/mL時，試紙條B/B0值與SAL濃度對數(shù)具有較好的線性關(guān)系(R2=0.995)，其線性回歸方程為y=-21.4lnx+10.407，半數(shù)抑制率濃度(IC50)達(dá)到0.143 ng/mL(n=5)。

圖6　　　　AuNFs試紙條定量檢測SAL標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6　　　　Calibration curve of AuNF-based strip for SAL quantitative detection

2.7　AuNFs試紙條檢測性能的評價

檢測9種與沙丁胺醇結(jié)構(gòu)類似的β腎上腺素興奮劑加標(biāo)尿樣(包括克倫特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、班布特羅、妥布特羅、溴布特羅、噴布特羅、特布他林以及馬布特羅)，評價AuNFs免疫層析試紙條的特異性，結(jié)果見圖7。從圖7結(jié)果可知：筆者制備的AuNFs免疫層析試紙條與以上9種β腎上腺素?zé)o明顯交叉反應(yīng)，表明該試紙條具有良好的特異性。在不含SAL的豬尿樣品中添加高(0.5 ng/mL)、中(0.15 ng/mL)、低(0.05 ng/mL)質(zhì)量濃度的SAL，AuNFs試紙條檢測,以試紙條批間、批內(nèi)的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)評價試紙條定量檢測SAL的準(zhǔn)確性與精密度，結(jié)果見表2。由表2可知，試紙條檢測不同濃度SAL的批內(nèi)回收率為101.53%～110.68%，批間回收率為98.86%～110.5%，RSD均小于10%，表明AuNFs免疫層析試紙條定量檢測豬尿中SAL具有良好的回收率及準(zhǔn)確度。為了進(jìn)一步評價AuNFs試紙條的實(shí)用性，用AuNFs試紙條檢測了20份經(jīng)LC/MS/MS確證為SAL陰性的豬尿樣品，AuNFs試紙條檢測實(shí)際豬尿樣品的最低檢測靈敏度定義為0.027 ng/mL(檢測結(jié)果的平均值加上3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差)；同時將該試紙條與商業(yè)化的ELISA試劑盒同時檢測50份豬尿樣品中的SAL含量，兩種方法檢測結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性評估，結(jié)果見圖8。由圖8可知，AuNFs試紙條與商業(yè)化的ELISA試劑盒檢測結(jié)果相關(guān)性方程為y=0.894 3x+0.081 2(R2=0.954 9)，以上結(jié)果表明兩種方法具有較好的一致性。

圖7　　　　AuNF試紙條的特異性評價Fig.7　　　　Specificity experiment of AuNF-based strip

SAL添加水平/(ng·mL-1)批內(nèi)(n=5)批間(n=5)平均水平/(ng·mL-1)回收率/%RSD/%平均水平/(ng·mL-1)回收率/%RSD/%0505531106847305521105046401501521015391601531025277100500541077415000499886584

圖8　　　　AuNFs試紙條及ELISA試劑盒檢測豬尿中 SAL的方法學(xué)比較Fig.8　　　　Methodology comparison of AuNFs-based strip (y-axis) and ELISA(x-axis) for the detection of 50 SAL spiked swine urine samples

3　結(jié)論

本研究以65 nmAuNFs為新型探針,成功地建立了免疫層析法快速定量檢測豬尿中SAL的新方法，該方法檢測SAL的IC50值達(dá)到0.143 ng/mL，檢測豬尿樣品的最低檢測限為0.027 ng/mL。相比于實(shí)驗(yàn)室常用的ELISA檢測方法，該方法僅需一臺便攜式讀取儀，17 min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)豬尿中SAL的高靈敏定量檢測，且不需復(fù)雜的操作以及專業(yè)的操作人員，適于 SAL的現(xiàn)場快速篩查檢測。

參考文獻(xiàn)：

[1]栗艷.“瘦肉精”的危害及防治[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘,2011,27(4):175.

[2]CHAI C,LIU G,LI F,et al.Towards the development of a portable sensor based on a molecularly imprinted membrane for the rapid determination of salbutamol in pig urine[J].Anal Chim Acta,2010,675(2):185-190.

[3]王鳳美,何京橙,張鴻偉,等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測動物血漿中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報,2015,6(12):5024-5028.

[4]陳新謙,金有豫,湯光.新編藥物學(xué)[M].16版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2007:436.

[5]ADAM A,ONG H,SONDAG D,et al.Radioimmunoassay for albuterol using a monoclonal antibody:application for direct quantification in horse urine[J].J Immunoassay,1990,11(3):329-345.

[6]CARTER W J,LYNCH M E.Comparison of the effects of salbutamol and clenbuterol on skeletal muscle mass and carcass composition in senescent rats[J].Metabolism,1994,43(9):1119-1125.

[7]劉宣兵,龐玉芳,侯玉澤,等.沙丁胺醇的毒副作用及其殘留檢測[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2008(4):83-85.

[9]吳時清,陳茹,林志雄,等.應(yīng)用競爭酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)檢測港澳活豬中克倫特羅殘留[J].檢驗(yàn)檢疫科學(xué),1999,9(4):17-18.

[10]邱陽生,楊根海,何方洋.β-興奮劑沙丁胺醇及其檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2002,23(4):50-52.

[11]畢玉香.瘦肉精的殘留危害及監(jiān)控對策[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2009,4(6):136.

[12]戴華,袁智能,黃志強(qiáng),等.飼料中鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇高效液相色譜測定[J].分析測試學(xué)報,2003,22(3):57-60.

[13]管健,王立媛,吳平谷,等.同位素作內(nèi)標(biāo)氣質(zhì)聯(lián)機(jī)測定動物源食品中4種β2-興奮劑的含量[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2007,17(12):2194-2196.

[14]韓京朋,吳小平,邱檢萍,等.動物尿液中沙丁胺醇?xì)埩魴z測試紙條的研制[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2014(4)：174-176.

[15]MAZHARS H R A,CHRYSTYN H.New HPLC assay for urinary salbutamol concentrations in samples collected post-inhalation[J].J Pharm Biomed Anal,2009,50(2):175-182.

[16]郭偉,楊麗君,時文春,等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定豬肉中3種β-受體激動劑殘留量[J].分析試驗(yàn)室,2010,29(4):91-98.

[17]YEE K C,LOWE E,JACOBSON G.Determination of albuterol enantiomers in animal tissue matrices by LC-MS/MS:application in therapeutic myoanabolic studies[J].Chromatographia,2011,74(3/4):355-358.

[18]吳巧麗,葉春生.膠體金免疫層析技術(shù)快速檢測沙丁胺醇?xì)埩鬧J].現(xiàn)代食品科技,2012(11):1595-1599.

[19]劉冰,王玲玲,童貝,等.沙丁胺醇免疫層析試紙條的應(yīng)用研究[J].食品研究與開發(fā),2016,37(18):124-128.

[20]CUI X，XING Q，XIONG Y，et al.Establishing of a method combined immunomagnetic separation with colloidal gold lateral flow assay and its application in rapid detection ofEscherichiacoliO157:H7[J].Chin J Anal Chem,2013,41(12):1812-1816.

[21]JI Y,REN M,LI Y,et al.Detection of aflatoxin B1with immunochromatographic test strips:enhanced signal sensitivity using gold nanoflowers[J].Talanta,2015,142:206-212.

[22]LI J,DUAN H,XU P,et al.Effect of different-sized spherical gold nanoparticles grown layer by layer on the sensitivity of an immunochromatographic assay[J].RSC Adv,2016,6(31):26178-26185.

[23]LI C,LUO W,XU H,et al.Development of an immunochromatographic assay for rapid and quantitative detection of clenbuterol in swine urine[J].Food Control,2013,34(2):725-732.

[24]XU P,LI J,HUANG X,et al.Effect of the tip length of multi-branched AuNFs on the detection performance of immunochromatographic assays[J].Anal Methods,2016,8(16):3316-3324.