盧　丹，徐　晴，江　凌，黃　和

(1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211800；3.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800)

真菌毒素是由曲霉菌屬、鐮刀菌屬或青霉菌屬在生長繁殖過程中產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物，能夠污染幾乎所有種類的食用、飼用農(nóng)產(chǎn)品以及中草藥等，嚴(yán)重危害人畜健康。據(jù)統(tǒng)計，全球25%的糧食作物受到真菌毒素的污染，造成的經(jīng)濟損失達(dá)數(shù)千億美元/年；我國每年在生產(chǎn)、儲存、運輸、銷售過程中受到真菌毒素污染的糧食有3 100多萬t[1]。因此，如何有效控制和消除食品、飼料中的各類真菌毒素，成為食品、飼料行業(yè)亟待解決的問題。

1　真菌毒素的種類和特征

據(jù)統(tǒng)計，目前對玉米、大豆、小麥以及飼料污染最嚴(yán)重的真菌毒素主要有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素和嘔吐毒素，這幾種毒素的控制和降解成為各國政府關(guān)注的焦點。

1.1　黃曲霉毒素

黃曲霉毒素(aflatoxin,AF)是由曲霉產(chǎn)生的一種二呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?，在紫外光下可發(fā)出熒光，根據(jù)熒光顏色的差異，分為黃曲霉毒素B(AFB藍(lán)色熒光)、黃曲霉毒素G(AFG綠色熒光)和黃曲霉毒素M(AFM藍(lán)紫色熒光)等[2]。黃曲霉毒素是目前發(fā)現(xiàn)的化學(xué)致癌物中最強的物質(zhì)之一，主要通過損害肝臟導(dǎo)致肝癌。此外，黃曲霉毒素還可誘發(fā)直腸癌、乳腺癌和骨癌等，其一般存在于玉米、花生、棉籽、稻谷以及大豆等多種農(nóng)作物中，以玉米和花生中的污染最為嚴(yán)重。而在黃曲霉毒素的幾種構(gòu)型中，AFB1的毒性最強[3]，AFM1、AFG1、AFB2和AFG2的毒性相對較弱。目前，全球已有100多個國家和地區(qū)針對食品和飼料中黃曲霉毒素的限量制定了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。美國標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定AFM1在牛奶和飼料中的含量分別不能超過0.5和300 μg/kg，而AFB1、AFB2、AFG1和AFG2在食品中的總量不超過20 μg/kg[4]；歐盟標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定乳制品中AFM1含量不能超過0.05 μg/kg，食用花生仁中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2總含量不超過4 μg/kg[5]。我國也對黃曲霉毒素在各類農(nóng)產(chǎn)品和食品中的含量有著嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)GB 2761—2011的有關(guān)規(guī)定：AFB在玉米中的限量為20 μg/kg，在大米和稻谷中為10 μg/kg，其他糧食作物中則為5 μg/kg；對于嬰兒食品而言，AFB和AFM的限量都僅為0.5 μg/kg[6]。

1.2　赭曲霉毒素

赭曲霉毒素(ochratoxin,OT)是由曲霉或青霉產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物，存在A(OTA)、B(OTB)、C(OTC)和α(OTα)等衍生結(jié)構(gòu)，其中OTA衍生物毒性最強，對農(nóng)作物的污染最為嚴(yán)重[7]。赭曲霉毒素主要對腎臟和肝臟產(chǎn)生損傷，具有致癌性、免疫毒性和致畸性等潛在危害[7-8]，其主要存在于小麥、玉米和花生等農(nóng)作物中。目前，多個國家或地區(qū)對食品和飼料中赭曲霉毒素的限量制定了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)：歐盟規(guī)定飼料用谷物中OTA的含量不能超過0.25 mg/kg，豬補充飼料和配合飼料中OTA的含量不超過0.05 mg/kg[8]，我國GB 2761—2011對OTA在各類谷物及豆制品中的限量為5 μg/kg[6]。

1.3　玉米赤霉烯酮

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是由鐮刀菌屬產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，主要存在于玉米、小麥、大麥和大米等谷物中[9]，具有較強的耐熱性，在110 ℃條件下需要處理1 h才能被完全破壞。此外，玉米赤霉烯酮作為雌激素的類似物，能夠作用于動物的生殖系統(tǒng)，導(dǎo)致其繁殖機能受到損害，甚至引發(fā)死亡。目前，各國對玉米赤霉烯酮的限量尚未達(dá)成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，我國對ZEN的限量有著嚴(yán)格的規(guī)定。根據(jù)GB 2761—2011的標(biāo)準(zhǔn)，ZEN在各類農(nóng)產(chǎn)品中的限量均為60 μg/kg[6]。歐盟對于ZEN在玉米內(nèi)的限量為3 000 μg/kg，在其他谷物中為2 000 μg/kg，而在豬飼料中的限量很低，僅為250 μg/kg[8]。

1.4　伏馬毒素

伏馬毒素(fumonisins,FB)是由串珠鐮刀菌產(chǎn)生的一種水溶性代謝產(chǎn)物，已發(fā)現(xiàn)的伏馬毒素有FA1、FA2、FB1和FB2等共11種，其中FB1最為常見，主要污染玉米及玉米制品。伏馬毒素能夠損害肝腎功能，且是一種致癌物，與食道癌的高發(fā)有一定的關(guān)系[10]。與玉米赤霉烯酮類似，目前國際上對食品和飼料中伏馬毒素的限量及檢測方法仍無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)：歐盟針對飼料原料、玉米及其產(chǎn)品中伏馬毒素(FB1+FB2)的指南限量為60 mg/kg，補充飼料和配合飼料中伏馬毒素(FB1+FB2)的指南限量為5 mg/kg；美國FDA規(guī)定食用家禽飼料(玉米及玉米副產(chǎn)品)中伏馬毒素(FB1+FB2+FB3)的指南限量為100 mg/kg，豬飼料(玉米及玉米副產(chǎn)品)中伏馬毒素(FB1+FB2+FB3)的指南限量為20 mg/kg[8]；此外，中國GB 2761—2011并沒有提及關(guān)于伏馬毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)。

1.5　嘔吐毒素

嘔吐毒素(deoxynivalenol,DON)是一種由鐮刀菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族化合物，主要存在于小麥、大麥和玉米等谷物籽實中，耐熱性較強，121 ℃高壓加熱25 min僅有少量破壞。嘔吐毒素對哺乳動物具有較強的毒性，能夠引起人和動物消化系統(tǒng)疾病和厭食癥，豬對嘔吐毒素最為敏感，家禽次之，反芻動物耐受能力最強[11]。近年來，各國紛紛意識到嘔吐毒素的危害，制定了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，限制農(nóng)副產(chǎn)品中嘔吐毒素的含量：根據(jù)美國FDA標(biāo)準(zhǔn)，飼料用谷物及其副產(chǎn)品(除玉米外)中嘔吐毒素的限量≤1 mg/kg；歐盟規(guī)定玉米及其副產(chǎn)品允許≤1.75 mg/kg的嘔吐毒素殘留[8]；中國衛(wèi)生部對農(nóng)副產(chǎn)品中殘留的嘔吐毒素規(guī)定為不得高于1 mg/kg[12].

2　真菌毒素的分布

由于產(chǎn)生真菌毒素的微生物所偏好的生長環(huán)境不同，真菌毒素在全球的分布具有一定的地域性。熱帶和亞熱帶是曲霉生長的最佳環(huán)境，而鐮刀菌最適宜在北美、歐洲和亞洲的氣候條件下生長。在炎熱、氣候潮濕的熱帶地區(qū)，黃曲霉毒素的污染比較嚴(yán)重。玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素和伏馬毒素主要在溫帶區(qū)域，如中國、歐洲及北美洲等地區(qū)。2016年，百奧明公司針對81個國家16 511個樣品的檢測發(fā)現(xiàn)，非洲作物中黃曲霉毒素的污染最為嚴(yán)重，檢出率為60%；北美玉米中伏馬毒素的檢出率高達(dá)66%，南美作物中主要的毒素為玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素；中東作物中存在的主要毒素為嘔吐毒素和伏馬毒素；歐洲作物中的主要毒素類型為嘔吐毒素[13]，驗證了真菌毒素的區(qū)域分布特性。但近年來隨著國際貿(mào)易進(jìn)程的加速，各類毒素的分布正逐漸呈現(xiàn)全球化的發(fā)展趨勢。

3　生物酶降解真菌毒素

對真菌毒素超標(biāo)的農(nóng)產(chǎn)品，最簡單的處理方法是丟棄或銷毀，但是，這將造成巨大的浪費和經(jīng)濟損失，同時也會產(chǎn)生嚴(yán)重的環(huán)境污染。因此，迫切需要開發(fā)安全、高效、低成本的真菌毒素脫除方法。常用的真菌毒素脫除方法有物理法、化學(xué)法和生物法?；瘜W(xué)法是采用酸、堿、氧化劑、醛或亞硫酸氣體以改變真菌毒素的結(jié)構(gòu)，該方法雖然能夠有效脫除毒素，但可能會對食品的營養(yǎng)價值和風(fēng)味產(chǎn)生影響，且存在化學(xué)物殘留的安全隱患。物理脫毒法是采用吸附劑將毒素進(jìn)行脫除，但該方法穩(wěn)定性差，且目前商品化的吸附劑對酶菌毒素的脫除效果仍有待加強[14]。生物法脫毒包括微生物法和生物酶法，前者是利用微生物對毒素的吸附或代謝能力，實現(xiàn)毒素的脫除，成本相對低廉，但并不適用于所有領(lǐng)域，如食品加工過程等。生物酶法脫毒是從微生物中發(fā)掘降解毒素的關(guān)鍵基因，利用基因技術(shù)構(gòu)建生物酶的高效表達(dá)工程菌，分離獲得純酶以進(jìn)行食品和飼料中真菌毒素的脫除。與微生物脫毒法相比，酶法脫毒具有更好的重復(fù)性、均一性和操作簡單等特點，受到了廣泛關(guān)注[15]。研究者針對黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素和嘔吐毒素均開發(fā)了相應(yīng)的降解酶(表1)，下文將具體闡述。

3.1　黃曲霉毒素的酶法降解

黃曲霉毒素的生物降解酶主要為氧化還原酶類。1998年，Liu等[16]發(fā)現(xiàn)在真菌Armillariellatabescens中存著可降解黃曲霉毒素的復(fù)合多酶體系，并在隨后的研究中分離獲得起降解作用的關(guān)鍵酶黃曲霉毒素氧化酶(AFO)。該酶主要作用于AFB1的二呋喃環(huán)，從而破壞黃曲霉毒素。Doyle等[17]報道寄生曲霉能夠產(chǎn)生降解黃曲霉毒素的乳過氧化物酶，并且黃曲霉毒素的降解率與酶含量成正相關(guān)性。Yehia[18]從白腐真菌Phanerochaeteostreatus中分離出一種能降解AFB1的錳過氧化物酶，其對AFB1的脫毒效率依賴于酶的濃度以及酶反應(yīng)的時間，在最優(yōu)條件下，1.5 U/mL的酶能夠在48 h內(nèi)降解90%的AFB1。此外，漆酶亦被發(fā)現(xiàn)具有降解黃曲霉毒素的功能，Alberts等[19]研究發(fā)現(xiàn)來自于白腐真菌Phanerochaeteostreatus的漆酶能夠降解黃曲霉毒素，118 U/L的漆酶對黃曲霉毒素的降解率為55%。Loi等[2]亦從P.pulmonarius和P.eryngii中分離獲得了漆酶，將其用于AFB1和AFM1的降解，發(fā)現(xiàn)僅存在漆酶的情況下，上述毒素的降解效率較低，而當(dāng)加入10 mmol/L氧化還原介質(zhì)后，反應(yīng)72 h，對AFB1的降解效率可從23%提高至90%，對AFM1的降解效率則可提高至100%。2010年，Novozymes公司對氧化還原介質(zhì)介導(dǎo)的漆酶降解黃曲霉毒素進(jìn)行了專利申請，該專利中漆酶來源于Streptomycescoelicolor，丁香酸甲酯作為氧化還原介質(zhì)，在此條件下，反應(yīng)24 h，漆酶對黃曲霉毒素的降解率達(dá)100%[20]。2017年，Xu等[3]從43株菌株中篩選獲得了BacillusshackletoniiL7，在37 ℃反應(yīng)72 h，BacillusshackletoniiL7對AFB1、AFB2和AFM1的降解率分別為92.1%、84.1%和90.4%。在此基礎(chǔ)上，Xu等[3]進(jìn)一步分離獲得了能夠降解黃曲霉毒素的新酶(芽孢桿菌黃曲霉降解酶)，該酶蛋白的分子量為2.2×104，最適反應(yīng)溫度和pH分別為70 ℃和8.0。

3.2　赭曲霉毒素的酶法降解

降解赭曲霉毒素的生物酶主要為羧肽酶，具體為羧肽酶A和羧肽酶Y。其中，羧肽酶A是最早被發(fā)現(xiàn)的具有赭曲霉毒素降解功能的生物酶，來源于牛胰腺中，對赭曲霉毒素的親和性相對較高，25 ℃條件下Km值為1.5×10-4mol/L[21]。羧肽酶Y來源于釀酒酵母，其對赭曲霉毒素的降解能力相對較弱，5 d僅能降解52%的赭曲霉毒素[22]。此外，脂肪酶、蛋白酶和酰胺酶等亦被發(fā)現(xiàn)具有降解赭曲霉毒素的功能。Abrunhosa等[22]從黑曲霉中分離獲得了可以降解赭曲霉毒素的純酶，該酶的最適反應(yīng)溫度和pH分別為37 ℃和7.5，在此條件下，其對赭曲霉毒素的降解活性高于羧肽酶A。Stander等[23]通過對系列水解酶的篩選，發(fā)現(xiàn)來源于黑曲霉的脂肪酶對赭曲霉毒素具有較高的降解能力，其對赭曲霉毒素的比活力達(dá)2.32 U/mg。Abrunhosa等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，一些商品化的酶亦具有降解赭曲霉毒素的能力，在pH7.5條件下反應(yīng)25 h，蛋白酶A對赭曲霉毒素的降解率為87.3%，胰酶對赭曲霉毒素的降解率為43.4%。Yu等[25]的專利中報道酰胺酶能夠降解赭曲霉毒素，當(dāng)用160 ng/mL的酰胺酶降解50 μg/mL的赭曲霉毒素，降解率可達(dá)83%。

3.3　伏馬毒素的酶法降解

早在1996年，Duvick等[26]已從E.spinifera中分離獲得可降解伏馬毒素的基因，并將其克隆至玉米等農(nóng)作物中，在相關(guān)酯酶、胺氧化酶及其他酶的作用下，伏馬毒素被逐漸水解、氧化。2009年，Heinl等[27]研究發(fā)現(xiàn)在Sphingopyxissp.MTA144的同一個基因簇上存在編碼羧酸酯酶和轉(zhuǎn)氨酶的2個基因，在這2個酶的作用下，F(xiàn)B1經(jīng)二步酶促反應(yīng)被降解：在羧酸酯酶的作用下FB1被降解為HFB1，在轉(zhuǎn)氨酶的作用下HFB1發(fā)生轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，并最終轉(zhuǎn)化生成2-酮基-HFB1。Hartinger等[28]將Sphingopyxissp.MTA144中編碼轉(zhuǎn)氨酶的基因FumI在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該酶的最適溫度為35 ℃，最適pH為8.5。2011年，Heinl等[29]從Sphingopyxissp.ATCC 55552克隆獲得了新的轉(zhuǎn)氨酶基因，并將其在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該酶亦具有降解HFB1的能力。百奧明研究中心從Sphingopyxissp.MTA144中分離獲得了酯酶，并開發(fā)出活性成分為純酶的FUMzyme?，這種酶制劑在動物的胃腸道內(nèi)能夠有效降解伏馬毒素為毒性顯著降低的化合物[30]。

3.4　玉米赤霉烯酮的酶法降解

能夠降解玉米赤霉烯酮的生物酶主要有三類：漆酶、內(nèi)酯水解酶和過氧化物酶。其中來源于Trametesversicolor的漆酶，反應(yīng)4 h對玉米赤霉烯酮的降解率為81.7%[31]。而在2009年，Novozyme公司的Viksoe-Nielsen等[32]發(fā)現(xiàn)在氧化還原介質(zhì)的存在下，來源于Streptomycescoelicolor的漆酶除了能降解黃曲霉毒素外，還能降解玉米赤霉烯酮，所采用的氧化還原介質(zhì)可以為丁香酸甲酯，37 ℃條件下反應(yīng)24 h，玉米赤霉烯酮可被完全降解。目前，對玉米赤霉烯酮降解酶最為關(guān)注的酶為內(nèi)酯水解酶，編碼基因為zdh101，是Takahashi-Ando等[33]2002年從來源于ClonostachysroseaIFO 7063中分離獲得，并將其在釀酒酵母中實現(xiàn)異源表達(dá)，脫毒實驗表明其能夠在37 ℃條件下反應(yīng)8 h或28 ℃條件下反應(yīng)48 h，實現(xiàn)2 μg/mL玉米赤霉烯酮的完全降解。唐語謙等[34]發(fā)現(xiàn)該酶主要通過作用于玉米赤霉烯酮的內(nèi)脂鍵實現(xiàn)毒素的降解，但由于可逆反應(yīng)的存在，該反應(yīng)并不能完全降解玉米赤霉烯酮，降解產(chǎn)物為β-ZOL，仍具有一定雌激素毒性，但毒性相對較低。此外，Yu等[35]研究發(fā)現(xiàn)來源于Acinetobactersp.SM04的過氧化物酶(Prx)能催化H2O2氧化降解玉米赤霉烯酮。在0.09%H2O2存在的條件下，30 ℃反應(yīng)6 h能降解玉米樣品中90%的玉米赤霉烯酮。目前，該酶具體的作用機制仍在研究中。

3.5　嘔吐毒素的酶法降解

嘔吐毒素降解主要有3種途徑，分別為糖基化、氧化和乙?；?，這3種反應(yīng)又有其對應(yīng)的酶進(jìn)行催化。Poppenberger等[36]于2003年發(fā)現(xiàn)了一種典型的嘔吐毒素糖基化酶——Arabidopsisthaliana中的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，能通過催化葡萄糖從UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移到嘔吐毒素的C3位的羥基上形成3-O-吡喃葡萄糖基-4-DON。2010年，Schweiger等[37]將A.thaliana中編碼UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶的基因在擬南芥體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，培養(yǎng)出具有DON抗性的農(nóng)作物。Ito等[38]于2013年在Sphingomonassp.KSM1中發(fā)現(xiàn)的P450細(xì)胞色素系統(tǒng)能夠?qū)I吐毒素氧化為16-羥基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(16-HDNO)，從而使其失去毒性。進(jìn)一步通過相關(guān)基因的胞外重組和表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了這一系統(tǒng)主要由Cyt450的編碼基因ddna及其對應(yīng)的內(nèi)源性還原物組成，其催化效率為6.4 mmol/(L·s)，對于質(zhì)量濃度約為100 μg/mL的嘔吐毒素，這一系統(tǒng)能在3 d內(nèi)達(dá)到將近100%的降解率。另一種降解嘔吐毒素的方法是將其3號位乙酰化。Kimura等[39]于1997年發(fā)現(xiàn)了一種能催化嘔吐毒素乙酰化的酶——單端孢甲-3-O-乙酰轉(zhuǎn)移酶并確定了其對應(yīng)的編碼基因，是一種從大腸桿菌中提取、由Tri101基因編碼的乙酰化酶，它能夠催化嘔吐毒素3號位乙酰化以達(dá)到解毒的目的。

3.6　不同真菌毒素及其相應(yīng)的降解方法

上文中主要闡述了各類真菌毒素的生物降解方法，這些方法中涉及了相關(guān)的微生物、酶及反應(yīng)，現(xiàn)將上述內(nèi)容總結(jié)，見表1。

表1　真菌毒素及其相應(yīng)的降解方法

4　真菌毒素降解酶的發(fā)掘

目前雖然已有能夠降解真菌毒素的相關(guān)酶的報道，但已實現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用的僅為能降解伏馬毒素的FUMzyme?，大部分酶因為降解效率低、穩(wěn)定性差等原因處于實驗室研究階段，針對真菌毒素降解酶的挖掘需進(jìn)一步的深入。

目前所發(fā)現(xiàn)的真菌毒素降解酶，主要是基于色譜分離法獲得。研究者在篩選獲得可降解真菌毒素微生物的基礎(chǔ)上，采用色譜法分別對微生物的胞外酶和胞內(nèi)酶進(jìn)行分離，將分離的各個組分分別進(jìn)行真菌毒素降解實驗，逐步確定起降解作用的關(guān)鍵酶。Zhao等[40]采用乙醇沉淀、色譜分離的方法從MyxococcusfulvusANSM068的胞外酶中分離獲得了可降解黃曲霉毒素的酶，經(jīng)測定該酶的分子量為3.2×104，最佳反應(yīng)溫度為35 ℃，最佳反應(yīng)pH為6.0，對AFG1的降解率可達(dá)96.96%，對AFM1的降解率可達(dá)95.8%。Abrunhosa等[41]采用丙酮沉淀和色譜分離法從黑曲霉中分離獲得可降解赭曲霉毒素的新酶，該酶的最適pH為7.5，最適反應(yīng)溫度為37 ℃，對赭曲霉毒素的最大反應(yīng)速率Vmax為0.44 μmol/(L·min)。雖然基于色譜分離技術(shù)能夠篩選獲得具有降解真菌毒素功能的新酶，但蛋白分離過程復(fù)雜，回收率低，需進(jìn)一步對分離所得的蛋白進(jìn)行鑒定，費時費力。雖然色譜分離法能夠獲得毒素降解相關(guān)酶，但由于微生物代謝過程非常復(fù)雜，目標(biāo)蛋白獲取的難度較大，過去10年中被報道的具有脫除真菌毒素功能的新酶僅有7個，需要開發(fā)更高效的毒素降解酶發(fā)掘方法。

5　真菌毒素降解酶的改造

隨著測序技術(shù)的發(fā)展和成本的不斷降低，利用高通量測序技術(shù)開展真菌毒素降解菌基因組信息的檢測已逐漸成為一種主流方式。2012年，Zhou等[42]發(fā)現(xiàn)菌株Devosia具有降解嘔吐毒素的能力，此時尚未見任何關(guān)于Devosia菌株基因組信息的報道，但截至目前，上傳至GenBank中的Devosia全基因序列達(dá)12個。不斷豐富的基因信息庫以及組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為真菌毒素降解酶的發(fā)掘提供了新的策略。Liuzzi等[43]在前期研究過程中篩選獲得了一株能夠降解赭曲霉毒素的不動桿菌ITEM 17016，為篩選獲得降解赭曲霉毒素的關(guān)鍵基因，分析了ITEM 17016在含/不含毒素培養(yǎng)基中生長時的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)有6個肽酶在含毒素的培養(yǎng)基中表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步將編碼羧肽酶PJ-1540的基因在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，從而發(fā)掘了降解赭曲霉毒素的新酶。隨著宏基因組技術(shù)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)等的不斷發(fā)展和成熟，預(yù)計未來越來越多具有降解毒素功能的酶將被挖掘。

目前針對酶法降解真菌毒素的研究主要集中于新酶的發(fā)掘以及酶學(xué)性質(zhì)的研究，但天然酶在食品、飼料中的應(yīng)用可能由于環(huán)境條件的限制，無法獲得理想的效果，往往需要采用蛋白質(zhì)工程對酶進(jìn)行改造，如增加酶的活性，pH、溫度穩(wěn)定性等，生物信息學(xué)的發(fā)展為脫毒酶結(jié)構(gòu)的解析及改造提供了有力的技術(shù)支撐。Dobritzsch等[44]從黑曲霉中發(fā)掘了一種可以降解赭曲霉毒素新酶，該酶具有較高的熱穩(wěn)定性，最適反應(yīng)溫度為66 ℃，最適反應(yīng)pH為6，且比羧肽酶A和羧肽酶Y具有更高的降解性能；在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對該酶進(jìn)行了純化、結(jié)晶和結(jié)構(gòu)解析，發(fā)現(xiàn)該酶屬于酰胺水解酶家族，具有雙金屬中心催化位點。通過對粉紅粘帚菌的內(nèi)酯水解酶ZHD101的純化和晶體培養(yǎng)，Peng等[45]解析了ZHD101的分子結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)ZHD101屬于α/β-水解酶家族，分子結(jié)構(gòu)由催化核心結(jié)構(gòu)域和α-螺旋帽子結(jié)構(gòu)域組成，底物結(jié)合在二者之間的深口袋中，靠近催化三聯(lián)體為Ser102-His242-Glu126，酶與底物的作用是通過氫鍵和非極性鍵的互作完成。玉米赤霉烯醇為玉米赤霉烯酮的衍生物，其中α-玉米赤霉烯醇的雌激素較玉米赤霉烯酮具有更高的毒性，而ZHD101能夠同時降解玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉烯醇，但對后者的降解效率僅為前者的40%，為提高ZHD101對α-玉米赤霉烯醇的降解效率，在獲得ZHD101晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，Xu等[46]進(jìn)一步研究了ZHD101分別與底物玉米赤霉烯酮、玉米赤霉烯純間的復(fù)合體結(jié)構(gòu)，通過二者結(jié)構(gòu)的比對，設(shè)計了系列突變位點修飾底物結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)，突變體V153H對α-玉米赤霉烯醇的催化活性較野生型提高了3.7倍，但同時保持了對玉米赤霉烯酮的催化活性。

6　酶法降解真菌毒素存在的問題與展望

真菌毒素污染給糧食與畜牧業(yè)的發(fā)展帶來了巨大的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重威脅著人類的健康和社會的發(fā)展。酶法降解真菌毒素技術(shù)與傳統(tǒng)的物理、化學(xué)好微生物脫毒方法相比，具有不可比擬的優(yōu)勢。但目前關(guān)于真菌毒素的酶降解技術(shù)大部分仍停留在起步階段，新酶的發(fā)掘工作仍舉步維艱，在過去的10年中，公開報道的可降解真菌毒素的新酶僅有7個。酶法脫毒技術(shù)的應(yīng)用尚存在以下幾方面的問題有待深入探索與研究：①雖然目前報道的可用于降解真菌毒素的微生物很多，但眾多的研究報道中毒素的代謝機理仍缺乏深入研究，制約了新酶的發(fā)掘；②某些真菌毒素的降解依賴于幾個酶的協(xié)同作用，如在脫羧酶和轉(zhuǎn)氨酶的共同作用下伏馬毒素被降解完全，這必將增加新酶發(fā)掘的難度；③同一樣品中幾種毒素往往共同存在[1]，故在利用酶法降解這些毒素時往往需要多個酶的參與，增加了工藝調(diào)控的難度；④一些酶對真菌毒素的作用是將其降解為毒性較小的化合物，如內(nèi)酯水解酶降解玉米赤霉烯酮的產(chǎn)物為低毒性的玉米赤霉烯醇，一定程度上限制了該酶在毒素降解中的應(yīng)用。

近年來，生物信息學(xué)的發(fā)展為新酶的發(fā)現(xiàn)提供了更為豐富的技術(shù)手段。利用宏基因組技術(shù)，通過提取特定環(huán)境中的微生物基因組DNA構(gòu)建基因組文庫，從文庫中篩選新的功能基因，已成為功能基因篩選的高效方法[47]；由于測序技術(shù)的發(fā)展，已有海量的基因數(shù)據(jù)資源被公布，根據(jù)催化反應(yīng)的需求，借助計算機輔助篩選，可以從龐大的基因數(shù)據(jù)庫中高效獲得具有優(yōu)良催化性能的新型生物酶[48]。而近幾年發(fā)展起來的無細(xì)胞蛋白表達(dá)等技術(shù)，為酶的高通量篩選提供了有效手段，能夠極大地縮短新酶的發(fā)掘周期[49]。因此，雖然生物酶法去除真菌毒素的研究起步較晚，發(fā)展相對緩慢，但隨著相關(guān)生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展，相信在不久的將來，越來越多可降解真菌毒素的生物酶將被發(fā)掘，并逐步從實驗室研究走向?qū)嶋H生產(chǎn)過程。

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