岳　苑，賈冰凝,馬桂娟

(寧夏回族自治區(qū)食品檢測(cè)中心，寧夏 銀川 750001)

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)簡(jiǎn)稱(chēng)單增李斯特氏菌，是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人畜感染，主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。它廣泛存在于自然界中，食品中存在的單增李斯特氏菌對(duì)人類(lèi)的安全具有危險(xiǎn)，該菌在4 ℃的環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖，是冷藏食品威脅人類(lèi)健康的主要病原菌之一[1]。因此，在食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)中，必須加以重視。

2017年6月23日，GB 4789.30—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》[2]頒布實(shí)施。與舊標(biāo)準(zhǔn)相比，新標(biāo)準(zhǔn)增加了第二法平板計(jì)數(shù)法和第三法MPN計(jì)數(shù)法[2]，同時(shí)，新版的CL09中5.4.6規(guī)定了微生物檢測(cè)領(lǐng)域在某些情況下需要列出各主要的不確定度分量，并做出合理的評(píng)估[3]。由于單增李斯特氏菌的定量方法是國(guó)標(biāo)修訂后新增的檢驗(yàn)方法，所以目前對(duì)該方法的測(cè)量不確定度評(píng)估的研究尚有不足，但是由于該方法與GB 4789.10—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》[4]中的第二法相似，所以在不確定度評(píng)定時(shí)可以借鑒金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)的不確定度評(píng)定。

本文中，筆者根據(jù) JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[5]和 GB 4789.30—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》[2]第二法平板計(jì)數(shù)法，探討對(duì)食品中單增李斯特氏菌檢驗(yàn)不確定度及評(píng)定方法，以期對(duì)測(cè)量數(shù)值作出合理評(píng)估。

1　材料與方法

1.1　材料

醬牛肉購(gòu)自銀川市銀華百貨超市；單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(ATCC19115)購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；0.85%生理鹽水，李氏增菌肉湯LB，李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2　方法

1.2.1樣品的制備

無(wú)菌操作稱(chēng)取醬牛肉樣品25 g，放入盛有225 mL LB肉湯的無(wú)菌均質(zhì)袋內(nèi)均質(zhì)，制成1∶ 10的樣品勻液[3]。將活化后的單增李斯特氏菌(ATCC19115)制成0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙?，?.5 mL于上述1∶ 10的樣品勻液，混勻。制備10倍系列稀釋樣品勻液，選擇2～3個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液，每個(gè)稀釋度的樣品勻液分別吸取1 mL，以0.3、0.3和0.4 mL的接種量分別加入3塊李斯特氏菌顯色平板，用無(wú)菌L棒涂布[2]。(36±1) ℃倒置培養(yǎng)24～48 h。

1.2.2樣品的測(cè)定

選擇有典型單增李斯特氏菌菌落的平板，且同一稀釋度3個(gè)平板所有菌落數(shù)合計(jì)在15～150 CFU之間的平板，計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)[1]。實(shí)際測(cè)量數(shù)值為1∶ 100 000的樣品勻液在3個(gè)單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上的菌落數(shù)分別為9、9和11 CFU，合計(jì)29 CFU。乘以稀釋倍數(shù)后，樣品最終測(cè)量數(shù)值為2.9×106CFU/g。兩組人員同時(shí)操作，每組進(jìn)行10次重復(fù)測(cè)量。

2　結(jié)果與討論

2.1　不確定度來(lái)源分析

分析不確定的來(lái)源為單次樣品測(cè)量過(guò)程中產(chǎn)生的不確定度及重復(fù)測(cè)量過(guò)程中產(chǎn)生的不確定度，見(jiàn)圖1。

圖1　　　　單核細(xì)胞增李斯特氏菌菌落數(shù)不確定度來(lái)源因果Fig.1　　　　The causality diagram of Listeria monocytogenes colony uncertainty sources

2.2　數(shù)學(xué)模型建立

依據(jù)GB 4789.30—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》第二法，設(shè)定某一個(gè)稀釋度典型菌落總數(shù)為A，該稀釋度確證為單增李斯特式菌的菌落數(shù)為B，該稀釋度用于確證試驗(yàn)的菌落數(shù)為C，稀釋因子為d，則單次測(cè)量單增李斯特氏菌菌落總數(shù)T可通過(guò)下式得出：

(1)

考慮重復(fù)性影響后，加入重復(fù)性后單增李斯特氏菌菌落總數(shù)TR為

TR=T+R

(2)

2.3　不確定度評(píng)定

2.3.1樣品制備過(guò)程中引入的不確定度

樣品制備過(guò)程包括稱(chēng)量和稀釋過(guò)程，不確定度主要是由電子天平稱(chēng)量(B 類(lèi))、玻璃器皿(B類(lèi))引入的。

1)電子天平稱(chēng)量引入的不確定度u天平

在樣品制備過(guò)程中，如1∶ 10初始稀釋液時(shí)，將25 g樣品加入225 mL增菌液中制得。此時(shí)，使用電子天平稱(chēng)取樣品。電子天平檢定證書(shū)顯示量程為0～500 g的允差絕對(duì)值為0.5 g，認(rèn)為均勻分布；重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差為1.0 g，兩項(xiàng)線(xiàn)性疊加，計(jì)算見(jiàn)式(3)。

(3)

即實(shí)際稱(chēng)量25 g樣品時(shí)，

2)量筒量取引入的不確定度u量筒

在樣品稀釋過(guò)程中，如1∶ 10初始稀釋液時(shí)，使用250 mL量筒量取增菌液，根據(jù)JJG 196—2006中規(guī)定，250 mL量筒允許誤差絕對(duì)值為1.0 mL，按三角分布處理，則

(4)

即實(shí)際量取225 mL LB培養(yǎng)基時(shí)，

2.3.2樣品稀釋過(guò)程中引入的不確定度

表1　逐級(jí)稀釋過(guò)程中量具校準(zhǔn)引起的不確定度

1)逐級(jí)稀釋引入的不確定度

由于第一步稀釋的方法( 25 g樣品+225 mL LB肉湯) 與以后各步稀釋的方法(1 mL樣液前一步稀釋的樣液+9 mL LB肉湯) 不同，而第二步稀釋的方法與以后各步的相同，本試驗(yàn)的結(jié)果在105數(shù)量級(jí)上，所以從第二步以后稀釋了4次，逐級(jí)稀釋的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(d)的計(jì)算見(jiàn)式(5)。

(5)

2)加入樣液引入的不確定度

一般情況下，對(duì)菌落培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，平皿上的菌落數(shù)肉眼觀(guān)察菌落的結(jié)果是清晰可辨的。因此，平皿上菌落數(shù)的不確定度可以忽略不計(jì)。但是，由于加樣體積1 mL分別以0.3 mL(V1)、0.3 mL(V1)和0.4 mL(V2)的接種量分別加入3塊單增李斯特菌顯色培養(yǎng)基上，所以這會(huì)因?yàn)榉侄任抗艿淖畲笤试S誤差而引入新的不確定度，根據(jù)JJG 196—2006，1 mL分度吸管最大允差絕對(duì)值為0.008 mL，按三角分布考慮，所以加入樣液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V)為

(6)

(7)

(8)

(9)

3)評(píng)定菌落總數(shù)測(cè)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

菌落總數(shù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(T)由逐級(jí)稀釋引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(d)和加入樣液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V)組成。

(10)

=0.019 3

單次測(cè)量單增李斯特氏菌菌落總數(shù)T=290 000 0 CFU，所以單次測(cè)量的不確定度

u(T)=0.019 3×290 000 0=559 70(CFU)

(11)

2.3.3樣品重復(fù)測(cè)量的不確定度u(R)

由于正常檢驗(yàn)測(cè)量次數(shù)少，為提高自由度，做A類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的預(yù)評(píng)定，由兩組人員同時(shí)操作，采用分兩組各10次重復(fù)測(cè)量的方法，評(píng)定其合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差及標(biāo)準(zhǔn)不確定度。重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2　重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)表

試驗(yàn)過(guò)程中，同一樣品共制作10份稀釋液，每份稀釋液測(cè)得一個(gè)測(cè)量值A(chǔ)參與計(jì)算T值，測(cè)量次數(shù)為1。

由表1數(shù)據(jù)，用貝塞爾公式[4]計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差sP及標(biāo)準(zhǔn)不確定度

(12)

(13)

(14)

正常檢測(cè)時(shí)，測(cè)量次數(shù)為1，重復(fù)測(cè)量的不確定度

(15)

自由度ν=(10-1)×2=18

(16)

2.3.4合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

合成不確定度uc(TR)由單次測(cè)量的不確定度u(T)和重復(fù)性檢測(cè)的不確定度u(R)合成計(jì)算。

(17)

=600 943(CFU)

2.3.5評(píng)定擴(kuò)展不確定度U

根據(jù)文獻(xiàn)[5]，當(dāng)k=2，則擴(kuò)展不確定

U=ku(TR)=2×600 943=120 188 6 (CFU)

(18)

2.3.6不確定度結(jié)果報(bào)告

本次單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法的檢測(cè)結(jié)果為(2.9±1.2)×106CFU/g，第二項(xiàng)為擴(kuò)展不確定度U的值，k=2。

2.4　討論

2.4.1致病菌中測(cè)量不確定度評(píng)定的必要性

食品中致病菌的含量直接反映出食品質(zhì)量的優(yōu)劣。新修訂的單核增生李斯特氏菌檢驗(yàn)方法[2]增加了平板計(jì)數(shù)法和MPN計(jì)數(shù)法，第二法適用于單增李斯特氏菌含量較高的食品，第三法適用于單增李斯特氏菌含量較低但是雜菌含量較高的食品[2]。新標(biāo)準(zhǔn)將單增李斯特菌的檢測(cè)逐步從定性轉(zhuǎn)為定量，因而在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中增加了實(shí)驗(yàn)操作環(huán)節(jié)、擴(kuò)大了檢測(cè)范圍，這就對(duì)實(shí)驗(yàn)室提供的檢測(cè)數(shù)據(jù)提出了更高要求。在實(shí)際檢測(cè)工作中，肉制品中單增李斯特氏菌的檢出率較其他致病菌更高，因此在檢測(cè)的過(guò)程中要特別注意。此外，文獻(xiàn)[7]中規(guī)定：檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有能力對(duì)每一項(xiàng)有數(shù)值要求的測(cè)量結(jié)果進(jìn)行測(cè)量不確定度評(píng)估，測(cè)量結(jié)果不確定度的評(píng)定可以使實(shí)驗(yàn)室提供的數(shù)據(jù)更具有效性、科學(xué)性、公正性和可靠性。

2017年6月新增了單增李斯特菌定量檢測(cè)方法，之前的檢驗(yàn)方法為定性方法，所以目前的研究較少，但是由于該定量方法與金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)的定量方法相類(lèi)似，因而能夠參考沈小芳等[8]和鄧小鴻等[9]的研究結(jié)果。

2.4.2不確定度數(shù)學(xué)模型的建立

食品化學(xué)樣品分析結(jié)果常以微量為主，且化學(xué)物質(zhì)有均一性，有較成熟計(jì)算不確定度的方法，而微生物污染的樣品分析結(jié)果常以宏量為主，測(cè)定的是活的物質(zhì)，不同的菌落之間有互生或拮抗等相互作用，是微生物測(cè)量不確定度評(píng)定的難點(diǎn)[10]。正是由于每次檢測(cè)菌落總數(shù)的結(jié)果較分散,很多人認(rèn)為微生物的不確定度可以忽略不計(jì)，在研究時(shí)采用Y=X的數(shù)學(xué)模型[11-13]，沒(méi)有考慮稱(chēng)量、稀釋等過(guò)程對(duì)不確定度產(chǎn)生的影響，因而不能得出正確的評(píng)定結(jié)果。

另外，因?yàn)椴煌瑯悠分g菌落總數(shù)結(jié)果的發(fā)散性較大，所以很多研究者認(rèn)為直接使用貝塞爾公式計(jì)算合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差所得到的不確定度不太合理[11,16-17]，而是將檢測(cè)結(jié)果取對(duì)數(shù)后，計(jì)算對(duì)數(shù)樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差,再計(jì)算不確定度。但本文是重復(fù)多次測(cè)量同一樣品，檢測(cè)結(jié)果之間發(fā)散性不大，所以可以直接使用貝塞爾公式計(jì)算。本研究確立的數(shù)學(xué)模型以及不確定度的來(lái)源分析能夠?yàn)橥?lèi)研究提供參考依據(jù)。

2.4.3多次檢測(cè)同一樣品來(lái)評(píng)定不確定度的問(wèn)題

雖然有專(zhuān)家認(rèn)為為對(duì)同一樣品進(jìn)行重復(fù)多次檢測(cè)在微生物學(xué)檢測(cè)是不適宜的[18]，并且在日常工作中，對(duì)同一樣品進(jìn)行多次重復(fù)檢測(cè)的可能性不大，但是不同樣品由于生產(chǎn)工藝、儲(chǔ)存條件等的不同，致病菌含量有較大差異，而且微生物數(shù)量是動(dòng)態(tài)變化，再者新的標(biāo)準(zhǔn)剛頒布實(shí)施不久，對(duì)于單增李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法的檢測(cè)數(shù)據(jù)較少，尋找自然污染的樣品比較困難，所以本試驗(yàn)選擇使用標(biāo)準(zhǔn)菌株人為污染樣品進(jìn)行測(cè)定。從新開(kāi)方法及保證結(jié)果的角度考慮，還是需要安排兩名或兩名以上檢測(cè)人員對(duì)樣品進(jìn)行重復(fù)檢測(cè),因而此結(jié)論的普遍性有待提高。

2.4.4其他幾個(gè)不確定度分量

由于在微生物檢驗(yàn)中，B類(lèi)不確定度對(duì)合成不確定度貢獻(xiàn)較小，重復(fù)測(cè)量帶來(lái)的不確定度占主要部分，所以，采用A類(lèi)評(píng)定測(cè)量不確定度。

除了本文列出的不確定分量以外，樣品的存儲(chǔ)采集、樣品的均質(zhì)、培養(yǎng)基配制的時(shí)間、培養(yǎng)基滅菌溫度、培養(yǎng)箱溫度以及培養(yǎng)時(shí)間這些分量不便于計(jì)算，而且對(duì)總不確定度的貢獻(xiàn)較小，所以不予考慮。這一方面可以通過(guò)制定作業(yè)指導(dǎo)書(shū)，統(tǒng)一規(guī)范操作規(guī)程，最大程度減少由此帶來(lái)的不確定度。

3　結(jié)論

本文中，筆者通過(guò)建立數(shù)學(xué)模型T=AB/Cd，分析不確定度來(lái)自樣品制備、樣品稀釋及重復(fù)測(cè)量的過(guò)程。樣品的存儲(chǔ)采集、樣品的均質(zhì)、培養(yǎng)基配制的時(shí)間、培養(yǎng)基滅菌溫度和培養(yǎng)箱溫度、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)總不確定度的貢獻(xiàn)較小。

本研究中，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法的檢測(cè)結(jié)果為(2.9±1.2)×106CFU/g，第二項(xiàng)為擴(kuò)展不確定度U的值，k=2。

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