陳振華，蔡　甜，熊曉輝，許文玲，郭曉博，任順利，韓錦雄，張海如,4

(1.佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院，廣東 佛山 528000；2.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800；3.南京諾唯贊生物科技有限公司，江蘇 南京 210034； 4.武漢生物工程學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430415)

20世紀80年代誕生的PCR技術(shù)奠定了近代分子生物學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)，然而直到熱穩(wěn)定的DNA聚合酶出現(xiàn)，PCR技術(shù)才得以被大規(guī)模、高通量應(yīng)用[1-2]。如今，PCR技術(shù)和熱穩(wěn)定DNA聚合酶已被廣泛應(yīng)用于疾病診斷與治療、傳染病檢測、藥物作用機理、食品檢測和法醫(yī)鑒定等各個領(lǐng)域[3-6]。在多方面的應(yīng)用中，對DNA聚合酶和PCR技術(shù)也提出了更高要求，如更高靈敏度、更低檢測下限、更高產(chǎn)量、更高保真度、更快的反應(yīng)速度、更廣的模板兼容范圍、對雜質(zhì)更高的耐受能力、更高GC兼容性以及更低的成本等[7-9]。PCR反應(yīng)性能一般可從兩個方面得以提高，一是使用不同的DNA聚合酶，二是對反應(yīng)條件進行優(yōu)化[10-14]。

應(yīng)用較為廣泛的Taq DNA聚合酶具有5′-3′ DNA聚合酶活性和5′-3′ DNA外切酶活性[15]，擴增能力強，但保真度不高。PfuDNA聚合酶分離于Pyrococcusfuriosis菌中，是另一類應(yīng)用較為廣泛的DNA聚合酶[16-17]，具有5′-3′ DNA聚合酶活性和3′-5′ DNA外切酶活性，擴增性能較弱，但保真度較高。Phanta DNA聚合酶是基于PfuDNA聚合酶改造而來的一類DNA聚合酶，保真度和行進性均得到大幅提升，并適用于廣泛的模板類型，是食品檢測、法醫(yī)鑒定和疾病診斷等方面的優(yōu)選用酶。

基于之前對于DNA聚合酶的研究，筆者對Phanta DNA聚合酶的反應(yīng)條件進行優(yōu)化，在反應(yīng)中調(diào)節(jié)不同的組分以增強聚合酶性能和PCR反應(yīng)效果，提高對血液、植物和食品等非處理標(biāo)本的擴增能力。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1DNA聚合酶、添加劑和試劑

Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase、Taq DNA Polymerase、dNTP、DNA Marker/Ladder、質(zhì)粒提取試劑盒、基因組DNA提取試劑盒、血液基因組提取試劑盒，諾唯贊生物科技有限公司；植物基因組提取試劑盒，天根生化科技有限公司；甘油、二甲基亞砜(DMSO)、二硫蘇糖醇(DTT)、MgCl2，Sigma公司；PCR引物由金斯瑞生物科技有限公司合成；其他試劑均為市售分析純。

1.1.2模板和抑制劑

大腸桿菌DH5α，諾唯贊生物科技有限公司；pEGFP質(zhì)粒，TaKaRa公司；Hela細胞，保存于諾唯贊生物科技有限公司細胞培養(yǎng)實驗室；全血，來自于佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院；水稻葉片，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)贈送；食品(玉米)，來自于超市。

1.1.3培養(yǎng)基和裂解液

液體LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10，NaCl 10，酵母粉 5。

固體LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10，NaCl 10，酵母粉 5，瓊脂粉 20。

裂解液：20 mmol/L Tris-HCl,100 mmol/L EDTA,0.1% 十二烷基磺酸鈉(SDS),pH 8.0。

1.2　方法

1.2.1DNA模板制備

將pEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，在含有50 μg/mL卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆作為PCR反應(yīng)模板。

血液基因組、細胞基因組和植物基因組的提取使用提取試劑盒，按照說明書進行提取。

取植物或食品浸泡入100 μL裂解液中，搗碎，加入蛋白酶K至終質(zhì)量濃度為200 μg/mL。60 ℃加熱10 min，然后95 ℃加熱10 min。充分混勻，室溫離心后取上清即可作為裂解液模板使用。

1.2.2PCR反應(yīng)

在50 μL PCR反應(yīng)體系中，加入10 μL Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase配套的5× SF Buffer(含有10 mmol/L MgSO4)，1 μL dNTP Mix (10 mmol/L each)，上下游引物(10 μmol/L)各2 μL和1 μL Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase。根據(jù)不同的試驗設(shè)計，分別加入不同濃度DMSO和MgCl2以及不同量的模板，用滅菌超純水補至50 μL。反應(yīng)條件設(shè)置為預(yù)變性95 ℃ 5 min；循環(huán)反應(yīng)：變性95 ℃ 30 s；退火60 ℃ 30 s；延伸72 ℃ 30 s/kb；共35個循環(huán)；徹底延伸72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后通過瓊脂糖凝膠電泳、EB染色，觀察反應(yīng)結(jié)果。Taq DNA聚合酶的反應(yīng)體系和程序參照說明書設(shè)置。

1.2.3添加劑及濃度優(yōu)化

選取甘油、DMSO、DTT等3種常用添加劑，測試其對Phanta DNA聚合酶擴增性能的影響[11]。在正常PCR反應(yīng)體系中，分別加入不同量的甘油、DMSO和DTT，使反應(yīng)體系中甘油和DMSO的質(zhì)量分數(shù)分別為1%、2.5%、5%、7.5%和10%；DTT的濃度為1、2.5、5、7.5和10 mmol/L。每個反應(yīng)體系加入50 ng Hela細胞基因組DNA作為模板。反應(yīng)結(jié)束后通過瓊脂糖凝膠電泳、EB染色，觀察反應(yīng)結(jié)果，確定最適添加劑及濃度。

1.2.4Mg2+濃度優(yōu)化

在PCR反應(yīng)體系中，分別加入不同量的MgCl2，使反應(yīng)體系中Mg2+終濃度分別為2.5、3、3.5、4和5 mmol/L。每個反應(yīng)體系加入50 ng Hela細胞基因組DNA作為模板。反應(yīng)結(jié)束后通過瓊脂糖凝膠電泳、EB染色，觀察反應(yīng)結(jié)果，確定最適Mg2+濃度。

1.2.5擴增靈敏度測試

分別使用正常反應(yīng)體系和加入5% DMSO和3 mmol/L Mg2+(終濃度)的反應(yīng)體系，加入不同量Hela細胞基因組DNA，使得每個反應(yīng)中基因組DNA量分別為0.05、0.1、0.5、1、10、25和50 ng，并以Taq DNA聚合酶作為對照。反應(yīng)結(jié)束后通過瓊脂糖凝膠電泳、EB染色，觀察反應(yīng)結(jié)果，確定可擴增的最低模板起始量。

1.2.6植物粗品擴增測試

分別使用正常反應(yīng)體系和加入5% DMSO和3 mmol/L Mg2+(終濃度)的反應(yīng)體系，加入不同植物(水稻、小麥、擬南芥)葉片粗提液進行擴增。并以Taq DNA聚合酶為對照。反應(yīng)結(jié)束后通過瓊脂糖凝膠電泳、EB染色，觀察反應(yīng)結(jié)果，確定對植物粗品的耐受能力。

1.2.7全血擴增測試

分別使用正常反應(yīng)體系和加入終質(zhì)量分數(shù)5%的DMSO和3 mmol/L Mg2+(終濃度)的反應(yīng)體系，加入不同體積(1、5、10、15、20和25 μL)的全血進行擴增，并以Taq DNA聚合酶作為對照。反應(yīng)結(jié)束后通過瓊脂糖凝膠電泳、EB染色，觀察反應(yīng)結(jié)果，確定可擴增的最高全血體積。

1.2.8食品粗品檢測測試

挑取1個含有pEGFP質(zhì)粒的大腸桿菌單克隆加入到100 μL食品(玉米)裂解液中，渦旋混勻。以混合物為模板，分別使用正常反應(yīng)體系和加入終質(zhì)量分數(shù)5% DMSO和3 mmol/L Mg2+的反應(yīng)體系，在體系中加入2、4、6、8和10 μL的混合液進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后通過瓊脂糖凝膠電泳、EB染色，觀察反應(yīng)結(jié)果，確定對食品粗品的耐受能力。

2　結(jié)果與討論

在分子診斷、食品檢測、法醫(yī)鑒定等應(yīng)用中，很多情況需要對樣品或樣品粗處理品進行直接檢測，有時即使提純的DNA也會含有一些很難去除的雜質(zhì)。這些雜質(zhì)中可能含有的PCR抑制劑極有可能會造成檢測失敗或出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，影響最終判定[7,18]。這就對耐受雜質(zhì)、耐受PCR抑制劑的PCR反應(yīng)體系提出了需求。普通DNA聚合酶對抑制劑耐受性較差，已有報道的和市售的耐抑制的酶有Klentaq、Phanta、Phusion等DNA聚合酶[19]。Klentaq雖有報道對血液具有一定耐受性，但其擴增性能較弱，靈敏度較低[20]；Phanta DNA聚合酶對植物、血液等具有一定耐受能力，并具有高保真性，且保真度優(yōu)于Phusion，因此，本研究中選用Phanta DNA聚合酶作為備選酶，旨在現(xiàn)有緩沖體系(Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase配套的5× SF Buffer)的基礎(chǔ)上，調(diào)整添加劑種類和濃度、Mg2+濃度、聚合酶量來進一步優(yōu)化反應(yīng)體系，使聚合酶擴增性能進一步提升，得以對植物粗品、血液和食品粗提液進行直接擴增。

2.1　添加劑種類和濃度對反應(yīng)體系的影響

添加劑種類和濃度對PCR反應(yīng)有重要影響，一般來說，添加劑的作用主要表現(xiàn)在保護酶、促進解鏈和退火等幾個方面[20-21]。對于不同的聚合酶，所需的最適添加劑種類和濃度均不同，使用相同添加劑對不同聚合酶催化的PCR反應(yīng)表現(xiàn)出的效果也不盡相同。筆者選取了甘油、DMSO和DTT 3種常見添加劑來優(yōu)化Phanta DNA聚合酶的擴增性能，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，甘油和DTT對于Phanta DNA聚合酶的擴增性能影響不大，但DMSO可以有效提升Phanta DNA聚合酶的擴增性能，并且在質(zhì)量分數(shù)為5%時效果最佳。

圖1　　　　添加劑種類和濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.1　　　　Optimization of the additives and their concentrations

2.2　Mg2+濃度對反應(yīng)體系的影響

Mg2+是DNA聚合酶作用必不可少的金屬離子，可有效釋放聚合酶活性，但濃度過高也會抑制酶活[14,22]。在PCR反應(yīng)中，Mg2+還會與dNTP結(jié)合，影響PCR反應(yīng)中游離Mg2+濃度。在不同的PCR反應(yīng)中，對于Mg2+有不同濃度需求。因此，筆者在添加劑優(yōu)化基礎(chǔ)上，在含有5% DMSO的反應(yīng)體系中加入不同濃度Mg2+，來尋找Phanta DNA聚合酶的最適Mg2+濃度，結(jié)果見圖2。由圖2可知，Mg2+濃度在3 mmol/L時，Phanta DNA聚合酶具有最高的活性。

圖2　　　　Mg2+濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.2　　　　Optimization of magnesium ion concentration

2.3　酶量對反應(yīng)體系的影響

在以上優(yōu)化添加劑種類、濃度和Mg2+濃度的基礎(chǔ)上，筆者對聚合酶使用量也進行了優(yōu)化。聚合酶在反應(yīng)體系內(nèi)使用量在一定范圍內(nèi)可達最優(yōu)，酶量過低反應(yīng)效率會降低，酶量過高則會可能引起非特異性擴增或抑制反應(yīng)進行。在2.2中優(yōu)化的反應(yīng)體系中分別加入不同量的聚合酶，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：50 μL體系中，使用1 U的Phanta DNA聚合酶即可達到最優(yōu)效果，酶量過低擴增效率過低，酶量過高會引起非特異性擴增。

圖3　　　　酶量優(yōu)化結(jié)果Fig.3　　　　Optimization of polymerase amount

2.4　優(yōu)化反應(yīng)體系有利于提高擴增靈敏度

根據(jù)以上實驗結(jié)果，筆者確定了在5× SF Buffer基礎(chǔ)上改進的Phanta DNA聚合酶的優(yōu)化反應(yīng)條件，即在5×SF Buffer基礎(chǔ)上加入5% DMSO、3 mmol/L Mg2+以及50 μL體系中使用1 U的Phanta DNA聚合酶。在此優(yōu)化體系的基礎(chǔ)上，考察Phanta DNA聚合酶的靈敏度是否得到提升。通過設(shè)立模板濃度梯度，考察了優(yōu)化的反應(yīng)體系對于反應(yīng)靈敏度的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知：Taq DNA聚合酶可對1 ng以上基因組模板進行有效擴增，對于0.5 ng基因組擴增效果明顯降低。對于未進行反應(yīng)體系優(yōu)化的Phanta DNA聚合酶，可對0.5 ng基因組進行有效擴增，而使用優(yōu)化的反應(yīng)體系，Phanta DNA聚合酶可對低至0.05 ng基因組進行有效擴增，靈敏度相比普通Taq DNA聚合酶提高10倍。Phanta DNA聚合酶相比于Taq DNA聚合酶，可以更好地結(jié)合雙鏈DNA，因此具有較高的靈敏度。

圖4　　　　優(yōu)化的反應(yīng)條件提高Phanta DNA聚合酶的靈敏度Fig.4　　　　Improved sensitivity of Phanta DNA polymerase with optimized reaction conditions

2.5　優(yōu)化反應(yīng)體系有助于提高對植物粗品的耐受度

植物育種過程需要大量鑒定基因型，提取大量植物DNA過程極為繁瑣復(fù)雜[23-24]，并且植物中含有多糖多酚、蛋白等大量PCR抑制劑[7]，粗品直接進行擴增較為困難。通過在反應(yīng)體系中加入不同體積的植物粗品作為模板，考察了加入5% DMSO、3 mmol/L Mg2+的優(yōu)化反應(yīng)體系中Phanta DNA聚合酶對于植物粗品的耐受程度，各實驗均為50μL體系，酶量為1 U，結(jié)果見圖5。由圖5可知：Taq DNA聚合酶對于部分植物如水稻葉片裂解液可以擴增，但產(chǎn)量不高；但對于小麥和玉米等植物葉片裂解液則無法擴增。未優(yōu)化條件的Phanta DNA聚合酶對于3種植物裂解液均可實現(xiàn)擴增，但擴增效果弱于直接使用DNA進行擴增的對照。經(jīng)過添加劑、Mg2+以及酶量優(yōu)化的反應(yīng)體系中，Phanta DNA聚合酶對3種植物葉片裂解液均可實現(xiàn)有效擴增，擴增效果顯著優(yōu)于未經(jīng)優(yōu)化的體系。

圖5　　　　植物葉片裂解液直擴結(jié)果Fig.5　　　　Electrophoresis of direct PCR with leaf lysis products

2.6　優(yōu)化反應(yīng)體系有助于提高對全血的耐受度

全血中含有多種細胞和分泌因子，便于進行有效快捷的醫(yī)療診斷[25-27]。同時也由于其中含有血紅素、血紅蛋白等成分，會抑制PCR反應(yīng)，對于分子診斷造成一定挑戰(zhàn)[19]。通過設(shè)置反應(yīng)中全血使用體積，考察了2.4中確立的優(yōu)化反應(yīng)體系中Phanta DNA聚合酶對于全血的耐受程度，結(jié)果見圖6。由圖6可知：Taq DNA聚合酶對于全血幾乎無耐受，少量全血即可抑制PCR反應(yīng)；Phanta DNA聚合酶對全血的耐受顯著優(yōu)于Taq DNA聚合酶，在體系中含有30%全血時，仍可實現(xiàn)擴增；優(yōu)化反應(yīng)體系后的Phanta DNA聚合酶在50 μL反應(yīng)體系中可耐受的全血體積為20 μL，達到總反應(yīng)體積的40%，相比未優(yōu)化反應(yīng)體系時，擴增產(chǎn)量和耐受血液體積顯著提高。

圖6　　　　優(yōu)化反應(yīng)條件有助于提高Phanta DNA 聚合酶對全血的耐受Fig.6　　　　Improved food crude extracts tolerance of Phanta DNA polymerase with optimized reaction conditions

2.7　優(yōu)化反應(yīng)體系有助于提高對食物粗品的耐受度

食品安全關(guān)系重大，食品中有毒有害微生物的檢測是食品安全檢測的重要項目[27]。食品中微生物具有含量較低、成分復(fù)雜等特點，如使用PCR法進行檢測，還需對食品中DNA進行提取[28]。如果能使用粗品進行直接PCR，將大大縮短食品檢測的時間。在玉米裂解液中加入少量含pEGFP質(zhì)粒的大腸桿菌[29]，通過設(shè)置反應(yīng)體系中加入的裂解液體積，考察了同2.4中確立的優(yōu)化反應(yīng)體系中Phanta DNA聚合酶對于食品粗品的耐受程度，結(jié)果見圖7。由圖7可知：Taq DNA聚合酶對于食品粗品在超過4μL粗品后即無法擴增；而優(yōu)化反應(yīng)體系后的Phanta DNA聚合酶在50 μL反應(yīng)體系中可對加入的多達8μL的粗品耐受，并可有效擴增其中的微量pEGFP質(zhì)粒。

圖7　　　　食品粗提液直擴結(jié)果Fig.7　　　　Electrophoresis of direct PCR with food crude extracts

3　結(jié)論

通過使用改良的Phanta DNA聚合酶，并對其反應(yīng)體系進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在SF Buffer中加入5% DMSO、3 mmol/L Mg2+以及50 μL體系中使用1 U聚合酶情況下，Phanta DNA聚合酶具有更優(yōu)的擴增性能。在此優(yōu)化條件下，Phanta DNA聚合酶的靈敏度相比Taq DNA聚合酶提高了10倍，并提高了對植物粗品、全血和食品粗品的耐受能力，可對粗品以及粗品中含有的微量微生物進行有效擴增，為植物直擴、分子診斷、食品快檢等實際應(yīng)用提供了原料和技術(shù)基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]EELES R A,WARREN W,STAMPS A.The PCR revolution[J].Eur J Cancer,1992,28(1):289-293.

[2]EBERLE J.Polymerase chain reaction (PCR)[J].Med Monatsschr Pharm,1995,18(6):152-158.

[3]KHOT P D,FREDRICKS D N.PCR-based diagnosis of human fungal infections[J].Expert Rev Anti Infect Ther,2009,7(10):1201-1221.

[4]ROMSOS E L,VALLONE P M.Rapid PCR of STR markers:applications to human identification[J].Forensic Sci Int Genet,2015,18:90-99.

[5]ZHANG K,LIN G,LI J.Quantitative nucleic acid amplification by digital PCRby clinical viral diagnostics[J].Clin Chem Lab Med,2016,54(9):1427-1433.

[6]馬小軍.PCR技術(shù)及其應(yīng)用[J].植物雜志,1996 (5):30-31.

[7]SCHRADER C,SCHIELKE A,ELLERBROEK L,et al.PCR inhibitors:occurrence,properties and removal[J].J Appl Microbiol,2012,113(5):1014-1026.

[8]OPEL K L,CHUNG D,MCCORD B R.A study of PCR inhibition mechanisms using real time PCR[J].J Forensic Sci,2010,55(1):25-33.

[9]王梁燕,洪奇華,張耀洲.實時定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用[J].中國細胞生物學(xué)學(xué)報,2004,26(1):62-67.

[10]HUE-ROYE K,VEGE S.Principles of PCR-based assays[J].Immunohematology,2008,24(4):170-175.

[11]HUBé F,REVERDIAU P,IOCHMANN S,et al.Improved PCR method for amplification of GC-rich DNA sequences[J].Mol Biotechnol,2005,31(1):81-84.

[12]KANG J,LEE M S,GORENSTEIN D G.The enhancement of PCR amplification of a random sequence DNA library by DMSO and betaine:application to in vitro combinatorial selection of aptamers[J].J Biochem Biophys Methods,2005,64(2):147-151.

[13]GHADESSY F J,ONG J L,HOLLIGER P.Directed evolution of polymerase function by compartmentalized self-replication[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(8):4552-4557.

[14]WILLIAMS J F.Optimization strategies for the polymerase chain reaction[J].Biotechniques,1989,7(7):762-769.

[15]WADA M,KLEIN C,SCHELL J,et al.A functional assay for Taq DNA polymerase in PCR[J].Biotechniques,1994,16(1):26-28.

[16]PICARD V,ERSDAL-BADJU E,LU A,et al.A rapid and efficient one-tube PCR-based mutagenesis technique using Pfu DNA polymerase[J].Nucleic Acids Res,1994,22(13):2587-2591.

[17]LIU E P,WANG Y,HE X H,et al.Whole blood PCR amplification withPfuDNA polymerase and its application in single-nucleotide polymorphism analysis[J].Genet Test Mol Biomarkers,2015,19(11):610-616.

[18]SIDSTEDT M,HEDMAN J,ROMSOS E L,et al.Inhibition mechanisms of hemoglobin,immunoglobulin G,and whole blood in digital and real-time PCR[J].Anal Bioanal Chem,2018,doi:10.1007/s00216-018-0931-z.

[19]KERMEKCHIEV M B,KIRILOVA L I,VAIL E E,et al.Mutants of Taq DNA polymerase resistant to PCR inhibitors allow DNA amplification from whole blood and crude soil samples[J].Nucleic Acids Res,2009,37(5):e40.

[20]RALSER M,QUERFURTH R,WARNATZ H J,et al.An efficient and economic enhancer mix for PCR[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,347(3):747-751.

[21]李紅.通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件擴增富含GC的DNA片段[J].蘇州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),1999,19(7):788-789.

[22]HARRIS S,JONES D B.Optimisation of the polymerase chain reaction[J].Br J Biomed Sci,1997,54(3):166-173.

[23]HAYASHI K,YOSHIDA H,ASHIKAWA I.Development of PCR-based allele-specific and InDel marker sets for nine rice blast resistance genes[J].Theor Appl Genet,2006,113(2):251-260.

[24]MA J,GUAN S C,ZHANG Z,et al.Single- and double-SSR primer combined analyses in rice[J].Genet Mol Res,2012,11(2):1032-1038.

[26]胡兆平,姚萍,王保龍,等.熒光定量PCR技術(shù)在血液篩查中的應(yīng)用及可行性分析[J].臨床輸血與檢驗,2002,4(1):7-9.

[27]WU V C.A review of microbial injury and recovery methods in food[J].Food Microbiol,2008,25(6):735-744.

[28]何小維,劉玉.PCR技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用[J].食品研究與開發(fā),2006,27(5):107-109.

[29]郝江燕,胡文忠,馮敘橋,等.食品中大腸桿菌生物檢測方法的研究進展[J].食品工業(yè)科技,2013,34(15):370-375.