董　雪，王麗雯，袁　建，倫麗麗，張　勛

(1.南京財(cái)經(jīng)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院 江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心 糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；2.江蘇美正生物科技有限公司，江蘇 無(wú)錫 214000)

硝基呋喃類藥物是硝基糠醛的Shiff堿衍生物，被廣泛使用在醫(yī)療和獸醫(yī)行業(yè)，用于治療潰瘍和胃腸道感染，同時(shí)對(duì)家禽、豬、兔子和魚類等宿主上的各種寄生蟲和病原微生物感染具有治療和預(yù)防作用。由于呋喃唑酮是一種具有遺傳毒性的致畸致癌物質(zhì)[1-2]，在動(dòng)物飼養(yǎng)過程中使用呋喃唑酮會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物健康受到損害，動(dòng)物體內(nèi)殘留的呋喃唑酮代謝物通過食物鏈的傳遞最終損害人體健康。呋喃唑酮不僅會(huì)破壞人肝癌細(xì)胞DNA的正常生長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在S期[3]，同時(shí)會(huì)在體內(nèi)快速代謝為3-氨基-2-惡唑烷酮(3-amino-2-oxazolidinone，AOZ)，導(dǎo)致血漿中母體化合物的濃度水平急劇降低。硝基呋喃類藥物在機(jī)體中代謝后，代謝產(chǎn)物在蛋白組織中累積，并能長(zhǎng)期穩(wěn)定存在[4]。

因此，自歐盟1995年禁止使用呋喃唑酮后，到目前為止許多國(guó)家也已經(jīng)禁止使用硝基呋喃。2002年，中國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定：禁止在動(dòng)物飼料和飲水中添加硝基呋喃[5]。然而，在許多國(guó)家的畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)中，仍然存在將氯霉素、孔雀石綠、硝基呋喃和甲硝唑等作為飼料添加劑非法使用的情況，其中，呋喃唑酮是使用最廣泛的呋喃藥物。因此，檢測(cè)養(yǎng)殖場(chǎng)和周邊環(huán)境中的呋喃唑酮?dú)埩魧?duì)于監(jiān)控呋喃唑酮的使用和保護(hù)環(huán)境具有十分重要的意義?；谶秽蛲拇x特點(diǎn)和結(jié)構(gòu)特性，目前大部分檢測(cè)方法是通過檢測(cè)與蛋白質(zhì)等組織結(jié)合的AOZ從而間接實(shí)現(xiàn)對(duì)呋喃唑酮的監(jiān)測(cè)。由于AOZ分子量只有102，沒有紫外吸收，并且在色譜柱中會(huì)很快洗脫，一般儀器檢測(cè)方法需要預(yù)處理，首先將其與2-硝基苯甲醛形成穩(wěn)定的化合物NPAOZ。目前，高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[6-10]等檢測(cè)方法都已經(jīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)呋喃唑酮代謝物的檢測(cè)和分析。然而，色譜檢測(cè)方法耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、成本高、需要昂貴的儀器，并且不適合用于高通量的篩選。

免疫學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、成本低、需求樣本量少等優(yōu)點(diǎn)，可以應(yīng)用于動(dòng)物組織、尿液等樣品，進(jìn)行快速和高通量篩查，廣泛用于小分子、核酸和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的快速檢測(cè)[11-16]。很多研究者報(bào)道了基于抗原抗體生物反應(yīng)檢測(cè)呋喃唑酮代謝物的方法[17-20]。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)雖然靈敏度比較高，但是操作步驟較繁瑣，需要酶標(biāo)儀等設(shè)備，不適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上的硝基呋喃類代謝產(chǎn)物的膠體金試紙條具有檢測(cè)快的優(yōu)點(diǎn)，但檢測(cè)限一般在1 μg/kg左右，與儀器檢測(cè)方法相比，仍有一定的差異。

本文中，筆者基于呋喃唑酮代謝物AOZ單克隆抗體，通過膠體金標(biāo)記技術(shù)制備膠體金快速檢測(cè)試紙條，建立基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)雞蛋中痕量呋喃唑酮代謝物的高靈敏、高特異性檢測(cè)，通過肉眼即可實(shí)現(xiàn)結(jié)果的判別。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

含呋喃唑酮代謝物的陽(yáng)性雞蛋樣品以及陰性樣本、呋喃唑酮代謝物小鼠單克隆抗體AOZ-Ab、呋喃唑酮代謝物牛血清白蛋白偶聯(lián)物AOZ-BSA，江蘇美正生物科技有限公司；呋喃妥因及其代謝1-氨基-2-內(nèi)酰脲(AHD)、呋喃西林及其代謝物氨基脲(SEM)、呋喃唑酮及其代謝物3-氨基-2-惡唑烷基酮(AOZ)、呋喃它酮及其代謝5-嗎啉甲基-3氨基-2-惡唑烷基酮(AMOZ)，德國(guó)Dr.E公司；鄰硝基苯甲醛(2-NBA)、牛血清白蛋白(BSA)，Sigma 公司；HRP-羊抗鼠二抗、羊抗鼠二抗，Jackson 公司；其他試劑均為市售分析純?cè)噭?/p>

1.2　主要儀器

電磁加熱攪拌套式恒溫器、攪拌子、除濕機(jī)、封口機(jī)、ZQ3500型數(shù)控快速斬切機(jī)、CT300型數(shù)控裁條機(jī)、HM3030型 XYZ三維劃膜噴金儀，上海金標(biāo)公司；MZ6000型臺(tái)式試紙條掃描讀數(shù)儀、自動(dòng)旋轉(zhuǎn)儀、熱封機(jī)，江蘇美正生物科技有限公司；Sartorius CN140型硝酸纖維素膜、H5015型特厚吸水墊、Ahlstrom 8964型樣品墊、PVC背板等，上海杰一生物公司。

1.3　方法

1.3.1AOZ單克隆抗體標(biāo)記金納米粒子制備

取一定體積的金納米粒子溶液(20 nm)加入K2CO3調(diào)節(jié)pH至8.2，同時(shí)將AOZ-Ab用0.002 mol/L、pH 8.2 硼酸鹽緩沖液稀釋到0.2 mg/mL。然后取15 mL無(wú)菌離心管，分別加入10 mL金溶液，在加入60、80、100和120 μg的抗體溶液后，蓋緊蓋子用手輕輕顛倒晃動(dòng)并搖勻。在自動(dòng)旋轉(zhuǎn)儀上混勻30 min。取100 g/L BSA 水溶液500 μL，緩慢滴加至金納米溶液中，繼續(xù)在自動(dòng)旋轉(zhuǎn)儀上混勻2 h。然后8 000 r/min離心30 min，除去多余的抗體和BSA，用金標(biāo)抗體洗滌液(含有100 g/L BSA，5 g/L PEG 6000的0.01 mol/L PBS)洗滌1次，最后加入1/10倍原始體積的金標(biāo)垂懸液(含有20 g/L BSA、5 g/L PEG 6000和25 g/L海藻糖的pH 8.0的0.01 mol/L Tris-HCl溶液)將金標(biāo)抗體濃縮10倍，放4 ℃冰箱備用。

1.3.2樣本前處理與檢測(cè)步驟

按照文獻(xiàn)[21]方法對(duì)雞蛋進(jìn)行前處理，并做適當(dāng)修改。首先將雞蛋樣本用均質(zhì)器攪拌成均一的蛋液，然后稱取(4±0.1)g蛋液于50 mL離心管中；分別用移液器加入5 mL 1 mol/L鹽酸和400 μL 0.05 mol/L鄰硝基苯甲醛(乙腈)溶液，在旋渦振蕩器上劇烈振蕩2 min；然后將50 mL離心管置于65 ℃水浴鍋中孵育30 min。孵育結(jié)束后用移液器分別加入1 mL 1 mol/L K2HPO4和1 mL 2 mol/L NaOH溶液，劇烈振蕩60 s混勻；然后用移液器加入5 mL乙酸乙酯，劇烈振蕩2 min；然后置于離心機(jī)中4 000 r/min離心5 min后，移取上層液體2 mL于5 mL離心管中，置于氮吹儀中60 ℃下吹干。用移液器加入2 mL正己烷于吹干的離心管中，劇烈振蕩1 min，至吹干固體油狀物完全溶解后，再加入400 μL 0.1 mol/L 磷酸緩沖液(PBS)，劇烈振蕩1 min，靜置分層或于離心機(jī)中4 000 r/min離心1 min，用移液器取下層溶液100 μL(勿取到上層正己烷)于微孔試劑中緩慢抽吸多次，至檢測(cè)樣品與微孔試劑充分混勻；使用計(jì)時(shí)器，開始計(jì)時(shí)；室溫(20～25 ℃)孵育3 min后，將試紙條插入微孔中，使之充分浸入溶液中，然后開始計(jì)時(shí)；室溫(20～25 ℃)反應(yīng)5 min后，取出試紙條并判讀結(jié)果。

1.3.3膠體金試紙條的制備

將金標(biāo)抗體濃縮溶液用金標(biāo)垂懸液分別按照10、12.5、15、20和25倍進(jìn)行稀釋，并按50 μL/孔體積加到96孔酶標(biāo)板中冷凍干燥。凍干程序：-35 ℃降溫60 min，維持200 min；預(yù)抽真空到10 Pa；-20 ℃ 升溫60 min，維持200 min，真空度10 Pa；-5 ℃升溫60 min，維持200 min，真空度10 Pa；25 ℃升溫60 min，維持200 min，真空度10 Pa。金標(biāo)溶液由液體變成干燥的餅狀，等冷凍干燥完畢后取出，用熱封機(jī)封口保存。

把呋喃唑酮牛血清白蛋白偶聯(lián)物代謝物(AOZK-BSA)用PBS稀釋到2.0、1.5、1.0、0.5和0.25 mg/mL，并在劃膜噴金儀上噴到硝酸纖維素膜上作為檢測(cè)區(qū)域，形成檢測(cè)線(T線)。將羊抗鼠二抗稀釋到0.2、0.3、0.4和0.5 mg/mL，噴到硝酸纖維素膜后作為控制區(qū)域，形成控制線(C線)，放在烘箱中過夜干燥待用。將已經(jīng)噴上檢測(cè)抗原和羊抗鼠二抗的硝酸纖維素膜(NC膜)、樣品墊和吸水墊依次疊加組裝成試紙條(圖1)，并用數(shù)控裁條機(jī)斬切成4 mm寬度的試紙條，干燥密封保存。

圖1　　　　膠體金標(biāo)試紙條示意Fig.1　　　　Structure of the colloidal gold test strip

1.3.4膠體金試紙條的優(yōu)化

取200 μL 0.01 mol/L、pH 7.4的PBS緩沖液，加到含有冷凍干燥的金標(biāo)抗體微孔中，用槍吹打均勻，室溫反應(yīng)3 min。將試紙條樣品墊端插入微孔溶液中。樣品溶液在層析作用下，從試紙條的樣品墊端，依次通過硝酸纖維素膜的檢測(cè)區(qū)域和控制區(qū)域向吸水墊一端流動(dòng)，微孔中溶液由于抗原抗體的特異性相互作用，引起納米金粒子的聚集，進(jìn)而顯示出C線和T線，5 min后將C線和T線顯色都明顯的檢測(cè)抗原和金標(biāo)抗體濃度配對(duì)記錄下來(lái)，進(jìn)行抑制測(cè)試。

將AOZ添加到陰性雞蛋樣品后，按前處理步驟進(jìn)行衍生化處理，測(cè)試試紙條的靈敏度。AOZ添加的梯度為0、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.3和0.5 μg/kg。按照上述方法進(jìn)行試紙條的檢測(cè)，利用讀數(shù)儀對(duì)檢測(cè)區(qū)域(T線)和控制區(qū)域的灰度值進(jìn)行掃描和記錄。檢測(cè)樣品的檢測(cè)線區(qū)域灰度值高于控制區(qū)域的灰度值時(shí)，可以判斷樣品為陰性；添加有AOZ樣品的試紙條檢測(cè)結(jié)果中，檢測(cè)線區(qū)域灰度值低于控制區(qū)域的灰度值時(shí)，可以判斷樣品為陽(yáng)性。

同時(shí)通過肉眼對(duì)試紙條的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷，陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果的最低檢測(cè)限(LOD值)定義：肉眼觀察T線顏色明顯比控制區(qū)域的灰度值弱時(shí)的檢測(cè)物濃度。當(dāng)樣品中AOZ的含量高于某一數(shù)值時(shí)，檢測(cè)線消失，只有控制線顯色，此為試紙條消線含量(cut-off值)。

1.3.5方法特異性檢測(cè)

按照AOZ膠體金試紙條方法分別對(duì)呋喃唑酮、呋喃妥因及其代謝物1-氨基-2-內(nèi)酰脲(AHD)、呋喃西林及其代謝物氨基脲(SEM)，呋喃它酮及其代謝物5-嗎啉甲基-3氨基-2-惡唑烷基酮(AMOZ)和鄰硝基苯甲醛(2-NBA)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.6與儀器方法比對(duì)

市場(chǎng)上不同品牌、不同攤位購(gòu)買的雞蛋，總計(jì)50批次，分別使用膠體金方法和儀器檢測(cè)方法(農(nóng)業(yè)部781公告方法)進(jìn)行檢測(cè)，并將結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

2　結(jié)果與討論

2.1　呋喃唑酮單克隆抗體標(biāo)記金納米粒子表征

本實(shí)驗(yàn)參考Frens檸檬酸三鈉還原法合成金粒子，改變加入的檸檬酸酸三鈉的量來(lái)控制所合成的納米離子的粒徑大小[22]。金納米粒子的透射電鏡(TEM)照片和紫外-可見光吸收?qǐng)D見圖2和3。金納米粒子的直徑在20 nm左右，最大吸收峰在520 nm附近。膠體金的顯色原理是抗體標(biāo)記的金納米粒子在硝酸纖維素膜上通過層析作用流動(dòng)，并在檢測(cè)區(qū)域和檢測(cè)抗原相互作用而引起金納米粒子堆積顯色。一般來(lái)說，金納米粒子溶液的外觀呈現(xiàn)透明的酒紅色。當(dāng)使用呋喃唑酮代謝物單克隆抗體使用量大于80 μg時(shí)，標(biāo)記好金納米粒子后顏色是暗紅色，沒有聚集現(xiàn)象。同時(shí)紫外掃描也顯示沒有聚集。為使得方法具有最佳靈敏度，選擇每毫升金納米粒子8 μg抗體標(biāo)記量。

圖2　　　　金納米粒子的電鏡照片F(xiàn)ig.2　　　　TEM image of the gold nanoparticle

圖3　　　　金納米粒子的紫外-可見光吸收Fig.3　　　　Ultraviolet-visible absorption of the gold nanoparticle

2.2　呋喃唑酮代謝物膠體金試紙條檢測(cè)方法的建立

通過讀數(shù)儀進(jìn)行灰度分析，可以減少肉眼對(duì)顏色深淺進(jìn)行判斷而引起的差異。通過對(duì)檢測(cè)抗原和金標(biāo)抗體濃度配對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析，選擇檢測(cè)區(qū)和控制線區(qū)域的灰度值信號(hào)在1 000左右的檢測(cè)條件，并且在此條件下，通過肉眼觀察C線顏色稍微比T線淺，并具有最佳檢測(cè)靈敏度。最終優(yōu)化結(jié)果表明：將金標(biāo)抗體濃縮溶液用金標(biāo)垂懸液稀釋到20倍；把AOZ-BSA用PBS稀釋到1 mg/mL，作為檢測(cè)區(qū)域形成T線；將羊抗鼠二抗稀釋到0.2 mg/mL，作為控制區(qū)域形成C線。

在雞蛋中添加呋喃唑酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)品，并進(jìn)行衍生化處理，處理后的溶液進(jìn)行試紙條檢測(cè)，結(jié)果見圖4。由圖4可知：通過肉眼判斷，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品含量為0.02 μg/kg時(shí)，檢測(cè)區(qū)域的T線顏色明顯淺于控制區(qū)域的顏色；當(dāng)樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)品含量高于0.5 μg/kg時(shí)，檢測(cè)線消失，只有控制線顯色；因此，呋喃唑酮代謝物膠體金試紙條消線含量(cut off 值)為0.5 μg/kg，肉眼最低檢測(cè)限0.02 μg/kg。目前，國(guó)內(nèi)硝基呋喃代謝物的膠體金檢測(cè)方法，其檢測(cè)限主要在1.0 μg/kg，判讀方法為比色方法，與儀器方法檢測(cè)限存在較大的差距，同時(shí)比色方法對(duì)判讀的要求較高，容易出現(xiàn)爭(zhēng)議。而本研究建立的膠體金試紙條檢測(cè)方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)呋喃唑酮代謝物的高靈敏度檢測(cè)。

圖4　　　　膠體金試紙條法檢測(cè)雞蛋中呋喃唑酮代謝物Fig.4　　　　Detection of AOZ in eggs by the colloidal gold test strip

2.3　呋喃唑酮代謝物膠體金試紙條檢測(cè)方法特異性分析

按照同樣的方法對(duì)呋喃唑酮、呋喃妥因及其代謝物1-氨基-2-內(nèi)酰脲(AHD)，呋喃西林及其代謝物氨基脲(SEM)，呋喃它酮及其代謝物5-嗎啉甲基-3氨基-2-惡唑烷基酮(AMOZ)和鄰硝基苯甲醛(2-NBA)，結(jié)果見圖5。從圖5中可以看出，50 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品均不能夠檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果，說明試紙條對(duì)AOZ的檢測(cè)具有高度特異性，此體系中的相關(guān)化學(xué)物質(zhì)的交叉反應(yīng)率小于0.1%。

圖5　　　　膠體金試紙條檢測(cè)方法特異性分析Fig.5　　　　Specificity of the colloidal gold test strip

2.4　儀器方法的比對(duì)

通過分別使用膠體金方法和儀器方法對(duì)購(gòu)買的30批雞蛋進(jìn)行檢測(cè)。儀器檢測(cè)共發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果6例，含量均高于0.5 μg/kg；而這4種雞蛋，通過膠體金方法檢測(cè)均顯示陽(yáng)性結(jié)果。說明研發(fā)的膠體金方法和儀器方法具有一致性。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于高特異性、高靈敏度的呋喃唑酮代謝物小鼠單克隆抗體建立膠體金快速檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)雞蛋中呋喃唑酮代謝物AOZ的高靈敏度檢測(cè)，其檢測(cè)限可以達(dá)到儀器方法的檢測(cè)限，因此可以避免快速檢測(cè)方法漏檢的發(fā)生。膠體金檢測(cè)方法成本低、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單且方便，可以用于現(xiàn)場(chǎng)硝基呋喃類違禁藥品的檢測(cè)，對(duì)于現(xiàn)場(chǎng)的快檢具有重要意義。

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