袁　毅，張一平，董曼佳，熊曉輝，嚴藝琳，張東升

(1.貴州省糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，貴州 貴陽 550001；2.江蘇省蘇微微生物研究有限公司， 江蘇 無錫 214063；3.南京工業(yè)大學 食品與輕工學院，江蘇 南京 211800)

黃曲霉毒素(aflatoxin，AFT)是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的一類有毒次生代謝物[1]，基本結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)和香豆素 (氧雜萘鄰酮)[2]。依據(jù)其化學結(jié)構(gòu)不同，主要有20余種衍生物[3]，其中，黃曲霉毒素B1的毒性和致癌性最強[4]，1993年被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機構(gòu)列為 Ⅰ 類致癌物[5]。歐盟在1999年頒布的《EC No.1525/98號法令》規(guī)定，直接提供人類食用的食物及組成食品的組分中，黃曲霉毒素 B1含量不得大于2 μg/kg[6]。我國國家標準GB 2761—2017中規(guī)定，黃曲霉毒素B1允許量標準為玉米、花生仁、花生油不得超過20 μg/kg，大米及其他食用油不得超過10 μg/kg，其他糧食、豆類、發(fā)酵食品不得超過5 μg/kg，嬰幼兒食品不得超過0.5 μg/kg[7]。

時間分辨熒光免疫層析法(TRFIA法)是利用抗原與抗體免疫反應的高度特異性以及納米稀土元素作為熒光標記示蹤物的高度靈敏性而建立起來的一種微量物質(zhì)檢測技術(shù)，具有簡便、快速、高靈敏的特點[8-10]。目前國內(nèi)已研發(fā)出專門針對真菌毒素的TRFIA技術(shù)及其檢測卡(或試紙條)，用于毒素含量的現(xiàn)場實時檢測[11-13]，并已將TRFIA法測定飼料中黃曲霉毒素B1列為農(nóng)業(yè)行業(yè)標準[14]。

目前，關于真菌毒素檢測不確定度的評定主要集中于酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[15-16]和高效液相色譜(HPLC)法[17-18]，未見關于TRFIA法的文章。為了推動TRFIA技術(shù)在食品、飼料檢測中的應用，對其測量不確定度進行評定是非常必需的。本文中，筆者采用TRFIA法測定大米中黃曲霉毒素 B1含量，根據(jù)CNAS-GL06：2006《化學分析中不確定度的評估指南》中提供的方法[19]，對結(jié)果進行包括不確定度來源及其量化和評定在內(nèi)的分析，旨在指導檢測人員關注TRFIA法檢測的關鍵環(huán)節(jié)，提高檢測結(jié)果的準確性和可靠性。

1　材料與方法

1.1　材料和試劑

樣品隨機抽樣自市售大米。

黃曲霉毒素B1時間分辨熒光免疫層析卡(簡稱檢測卡)，江蘇省蘇微微生物研究有限公司。

甲醇、蔗糖、吐溫-20、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O，國藥集團上海生化試劑公司(均為分析純)。黃曲霉毒素B1標準溶液、牛血清白蛋白(BSA)，美國Sigma公司(純度均大于98%)。0.2 mol/L Na2HPO4緩沖液(71.63 g的Na2HPO4·12H2O，用水溶解并定容到1 L)。0.2 mol/L NaH2PO4緩沖液(31.20 g的NaH2PO4·2H2O，用水溶解并定容到1 L)。pH7.2、0.1 mol/L的磷酸緩沖液PB(取0.2 mol/L Na2HPO4緩沖液360 mL， 0.2 mol/L NaH2PO4緩沖液140 mL，用水定容至1 L)。1.5 g蔗糖、0.2 g牛血清白蛋白、2.5 g吐溫-20，溶解于100 mL PB中，制成樣品稀釋液。

以上實驗用水均符合GB/T 6682—2008中一級水的要求[20]。

1.2　儀器設備和計量器具

PL203型電子分析天平(分度值0.01 g、最大量程210 g)，梅特勒-托利多(上海)；DFY-500型搖擺式高速中藥粉碎機,溫嶺市林大機械有限公司；GKC214型恒溫水浴鍋(溫控范圍為室溫～100 ℃，水溫波動≤0.5 ℃，溫差≤1 ℃)，上海蘇達實驗儀器有限公司；MX-F型振蕩器，北京大龍實驗室；SW-2型時間分辨熒光分析儀(激發(fā)波長(365±5) nm、檢測波長(615±5) nm)，在0.00～1.00比值(T/C除以T0/C0)范圍內(nèi)的熒光強度重復性為0.5%，江蘇省蘇微微生物研究有限公司。

50 mL玻璃量筒(最大容量允差±0.5 mL)、100 mL玻璃量筒(最大容量允差±1.0 mL)，BOMEX公司；200 μL微量移液器(最大容量允差±1.2 μL)、1 000 μL微量移液器(最大容量允差±5.0 μL)，Thermo公司。

1.3　提取方法

將樣品粉碎至全部通過0.9 mm分樣篩，充分混合均勻。

準確稱取粉碎后的樣品5.00 g于250 mL三角瓶中，加入50 mL 70%(體積分數(shù))甲醇溶液，搖床振蕩提取20 min，經(jīng)定性濾紙和布氏漏斗過濾，收集濾液。取100 μL的該濾液與600 μL室溫下的樣品稀釋液，經(jīng)振蕩器混合，即得待測試樣。

1.4　測定步驟

平衡：將檢測卡從冷藏狀態(tài)(2～8 ℃)取出，放置室溫平衡15 min。

測定：準確移取100 μL待測試樣，加到檢測卡的試樣孔中；室溫下反應10 min后，將其放入時間分辨熒光分析儀中；選擇激發(fā)波長365 nm、檢測波長615 nm，點擊儀器主界面“測量”菜單中“樣品及時測量”按鈕，檢測T線熒光強度與C線熒光強度，由儀器讀出T/C值(T線與C線熒光強度比值)。

1.5　數(shù)據(jù)計算

1.5.1標準曲線制備

1)準確吸取黃曲霉毒素B1標準溶液于10 mL容量瓶中，甲醇定容，配制成5 ng/mL的標準儲備液,準確移取標準儲備液,用10%甲醇+90%樣品稀釋液定容，配制成質(zhì)量濃度為0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5 ng/mL的黃曲霉毒素B1標準工作溶液。

2)由低濃度到高濃度，分別取標準工作溶液100 μL加至檢測卡的試樣孔中，于25 ℃恒溫水浴鍋中反應10 min后，將其放入時間分辨熒光分析儀中，在激發(fā)波長365 nm、檢測波長615 nm條件下，檢測T線熒光強度與C線熒光強度，由儀器讀出T/C值。

3)以標準工作溶液的濃度對數(shù)值(lgXi)為橫坐標，以各濃度標準工作溶液的T/C值與0 ng/mL標準液的T0/C0值的比值(Yi)為縱坐標，繪制標準曲線。

1.5.2試樣中毒素濃度的計算

按照“1.4測定步驟”測得試樣的T/C值，再除以0 ng/mL標準液的T0/C0值；根據(jù)所得比值，從標準曲線上查出試樣中黃曲霉毒素B1的濃度對數(shù)值lgX樣，求反對數(shù)計算出試樣中黃曲霉毒素B1的濃度值X樣(ng/mL)。

1.6　數(shù)學模型

樣品中黃曲霉毒素B1含量(C)的計算公式為

(1)

式中：C—樣品中黃曲霉毒素B1含量，μg/kg；X樣—試樣中黃曲霉毒素B1的質(zhì)量濃度，ng/mL；V—提取液的體積，50 mL；n—稀釋倍數(shù)，n=7；m—樣品取樣的質(zhì)量，5 g；f—回收率校正因子， 1.005 9。

1.7　不確定度分量的來源

測定步驟主要包括樣品稱量、毒素萃取、濾液稀釋、檢測卡平衡、免疫層析反應、熒光強度讀數(shù)、標準曲線制備和數(shù)據(jù)處理等過程，這一系列過程都會引入誤差。

但在實際測定中，如標準曲線制備、萃取、平衡、反應等操作引入的不確定度是難以量化的。因此，結(jié)合實際工作可以采用標準曲線擬合、回收率校正因子、重復性等方法來對這些步驟的不確定度進行評定，即指A類評定，主要有①標準曲線擬合引入的不確定度Ux；②回收率校正因子的不確定度Ur；③重復性檢測引入的不確定度Uc。

對于稱量、量取、稀釋、加樣、反應時間、讀數(shù)和數(shù)據(jù)處理等引入的不確定度，可以通過天平、量筒、微量移液器和時間分辨熒光分析儀等的誤差以及線性相關系數(shù)來評定，屬B類評定，主要有①樣品稱量引入的不確定度Um；②樣品提取引入的不確定度Us；③TRFIA實驗操作過程引入的不確定度Up；④時間分辨熒光分析儀讀數(shù)引入的不確定度Ui；⑤數(shù)據(jù)處理引入的不確定度Ud。

2　結(jié)果與討論

2.1　不確定度分量的量化和評定

2.1.1標準曲線擬合引入的不確定度

按照“1.5.1標準曲線制備”的描述，對質(zhì)量濃度分別為0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5 ng/mL共7個黃曲霉毒素B1標準工作溶液，各做2次平行測定，測定結(jié)果見表1。

以標準工作溶液各濃度對數(shù)值(lgXi)為橫坐標，以標準工作溶液各濃度(T/C)/(T0/C0)平均值(Yi)為縱坐標，繪制標準曲線(限于篇幅，文中未列出)。根據(jù)表1，擬合得標準曲線回歸方程為：Yi=-0.525lgXi-0.111 4，r=0.993 6。

標準曲線的標準偏差SR和計算見式(2)。

(2)

式中：lgXi、Yi分別為表1中第3列和第7列的各項數(shù)據(jù)；n為標準工作溶液的測定總次數(shù)，n=7×2(7個標準質(zhì)量濃度，每個濃度測2次)。

表1　系列標準工作溶液的T/C值和Yi值(n=14)

標準曲線擬合引入的關于濃度對數(shù)值(lgX樣)的標準不確定度U(lgX)的計算方法：稱取同一粉碎后的樣品10份，然后按照“1.3 提取方法”制備成10份待測試樣液，采用“1.4測定步驟”進行測定，每份樣平行測定2次，測定結(jié)果見表2。

表2　試樣液測定結(jié)果(p=20)

標準曲線擬合引入的關于濃度值的相對標準不確定度Ux相對的計算方法如下。

(3)

式中：p為試樣液的測定總次數(shù)，p=10×2(10份待測試樣液，每份樣測2次)；n為標準工作溶液的測定總次數(shù)，n=7×2(7個標準質(zhì)量濃度，每個濃度測2次)。

鑒于這兩點原因，本文中，筆者參照微生物計數(shù)測量的不確定度評估文獻[21-22]，通過計算真實濃度值(X真)的取值區(qū)間而求出關于濃度值的標準不確定度Ux，再計算出相對標準不確定度。

試樣的真實濃度對數(shù)值范圍lgX真=lgX樣±0.008 110=lg0.075 23±0.008 110=-1.123 61±0.008 110

求反對數(shù)計算出試樣的真實濃度值區(qū)間X真=10(-1.123 61±0.008 110)=0.073 838～0.076 648 (ng/mL)

Ux=±(0.076 648-0.073 838)/2=±0.001 405 (ng/mL)

則標準曲線擬合引入的相對標準不確定度Ux相對的計算公式為

(4)

2.1.2回收率校正因子的不確定度

稱取同一粉碎后的樣品3份，按5、10和20 μg/kg 3個不同濃度水平加入黃曲霉毒素B1標準品，然后立即按照“1.3 提取方法”制備成3份待測試樣液，采用“1.4測定步驟”進行測定，每份樣平行測定3次，根據(jù)測定結(jié)果計算回收率，見表3。

根據(jù)表3的結(jié)果，按照貝塞爾公式計算樣本回收率的標準偏差,見式(5)。

%

(5)

式中：Xi為表3中第2列的各項數(shù)據(jù)；n為試樣液的測定總次數(shù)，n=3×3(3份試樣液，每份測3次)。

回收率校正因子的標準不確定度Ur的計算公式為

%

(6)

則回收率校正因子的相對標準不確定度Ur相對的計算公式為

(7)

2.1.3重復性檢測引入的不確定度

稱取同一粉碎后的樣品10份，然后按照“1.3 提取方法”制備成10份待測試樣液，采用“1.4測定步驟”進行測定，每份樣平行測定2次，測定結(jié)果見表4。

根據(jù)表4的結(jié)果，按照貝塞爾公式計算樣本重復性檢測的標準偏差，見式(8)。

(8)

重復性檢測引入的標準不確定度Uc，計算見式(9)。

(9)

則重復性檢測引入的相對標準不確定度Uc相對，計算見式(10)。

(10)

表4　樣品重復測定結(jié)果(n=20)

2.1.4樣品稱量引入的不確定度

為了計算方便，設樣品實際稱質(zhì)量為5.00 g，則樣品稱量引入的相對標準不確定度

Um相對=Um/5.00=0.004 082/5.00=0.000 816 4

2.1.5樣品提取引入的不確定度

1)甲醇純度的相對標準不確定度計算

配制70%甲醇溶液引入的相對標準不確定度計算方法如下。

2)量取70%甲醇溶液引入的相對標準不確定度計算

量取70%甲醇溶液引入的相對標準不確定度為

3)濾液稀釋引入的相對標準不確定度計算

則樣品稀釋引入的相對標準不確定度為

將以上四項合成，則樣品提取引入的相對標準不確定度為

2.1.6TRFIA實驗操作過程引入的不確定度

1)微量移液器加樣引入的相對標準不確定度計算

Up1相對=0.692 8/100=0.006 928

2)反應時間的相對標準不確定度計算

Up2相對=2.886 8/(10×60)=0.004 811

將以上兩項合成，則TRFIA實驗操作過程引入的相對標準不確定度為

2.1.7時間分辨熒光分析儀讀數(shù)引入的不確定度

根據(jù)儀器檢定證書提供，SW-2型時間分辨熒光分析儀在0.00～1.00比值(T/C除以T0/C0)范圍內(nèi)的熒光強度重復性為0.5%，則儀器讀數(shù)引入的相對標準不確定度為

Ui相對=0.005

2.1.8數(shù)據(jù)處理引入的不確定度

本文中，筆者通過制備標準曲線圖形來讀取和計算大米樣品中的黃曲霉毒素B1含量，在這個過程中必然帶來數(shù)據(jù)處理上的不確定度，該不確定度可以通過線性相關系數(shù)來反映。

鑒于所測定的大米樣品中黃曲霉毒素B1含量總是在一段標準曲線內(nèi)(0～0.5 ng/mL)呈線性關系，則該段區(qū)間內(nèi)曲線的線性相關系數(shù)就表征了該含量值的不確定度。根據(jù)實驗過程中經(jīng)驗數(shù)據(jù)，r=0.993 6，則數(shù)據(jù)處理引入的近似相對標準不確定度為

Ud相對=0.006 4

2.2　合成不確定度

將從2.1.1～2.1.8各個不確定度分量及其評定結(jié)果，匯總列于表5中。

表5　不確定度分量及其評定結(jié)果匯總

由表5可知，本文采用TRFIA法測定大米中黃曲霉毒素B1含量，其中標準曲線擬合與重復性檢測帶來的相對標準不確定度分別為20.82%和23.27%，總占比為44.09%。吳彬等[23]采用ELISA法測定月餅中黃曲霉毒素B1含量，而張施敬等[24]采用ELISA法測定花生油中黃曲霉毒素B1含量，標準曲線擬合與重復性檢測帶來的相對標準不確定度總占比分別達到了56.09%和80.35%。不確定度均主要來源于標準曲線擬合與重復性檢測，原因可能是TRFIA法與ELISA法都基于抗原與抗體的特異性免疫反應，對于免疫檢測不可能100%完全重復，在不確定度分量的影響力方面表現(xiàn)出共同的特征。

因各不確定度分量相互獨立，故將表5中的相對標準不確定度進行合成，則得到TRFIA法測定大米中黃曲霉毒素B1含量的相對標準合成不確定度為

2.3　總不確定度(擴展不確定度)

按國際慣例，取置信概率為95%，包含因子k=2，則TRFIA法測定大米中黃曲霉毒素B1含量的相對標準總不確定度為

張施敬等[24]采用ELISA法測定花生油中黃曲霉毒素B1含量以及吳彬等[23]采用ELISA法測定月餅中黃曲霉毒素B1含量，相對標準總不確定度分別為5.33%和3.62%。本文采用TRFIA法測定大米中黃曲霉毒素B1含量，相對標準總不確定度略高于前兩篇文獻。分析原因，除了與測定樣品、測定條件、測定步驟和儀器讀數(shù)不同有關外，TRFIA法與ELISA最大的區(qū)別在于，前者為樣本在層析膜上流動的免疫檢測，因此流速對測試的結(jié)果影響很大，有可能通過A類不確定度和B類不確定度的分量表現(xiàn)出來。

2.4　測量不確定度報告

TRFIA法測定大米中黃曲霉毒素B1含量的結(jié)果表示為

C=5.235 2(1±0.074 06)μg/kg，或C=(5.235 2±0.387 7)μg/kg，置信概率p=95%。

3　結(jié)論

本文中，筆者通過各種不確定度分量的分析，采用TRFIA法測定大米中的黃曲霉毒素B1含量，其不確定度主要來源于標準曲線擬合、重復性檢測與樣品提取，分別占比20.82%、23.27%和19.35%；次要來源是回收率校正因子、TRFIA實驗操作、時間分辨熒光分析儀讀數(shù)和數(shù)據(jù)處理，分別占比13.53%、9.40%、5.57%和7.13%；而樣品稱量導致的不確定度可以忽略不計。因此，在實際檢測工作中，應首先制備一條準確且穩(wěn)定的標準曲線，并適當增加平行樣的測定次數(shù)；此外，提取過程中還需注意溶液配制、量取和稀釋等操作的準確度，這些關鍵環(huán)節(jié)對提高TRFIA法的準確性和可靠性都具有非常重要的指導作用。

本文采用TRFIA法測定大米中黃曲霉毒素B1的結(jié)果為(5.235 2±0.387 7)μg/kg，即有95%的可能性在4.847 5～5.622 9 μg/kg范圍內(nèi)。根據(jù)國家標準GB 2761—2017中規(guī)定[7]，稻谷、糙米、大米中黃曲霉毒素B1含量標準應小于10 μg/kg，被測大米可判斷為合格樣品。對測定結(jié)果給出了一個較準確的波動范圍，尤其在檢測結(jié)果接近標準規(guī)定臨界值時，可以降低誤判風險。

總之，TRFIA法適用于現(xiàn)場實時監(jiān)控和大批量樣品的分級篩選，在大米質(zhì)量檢驗中具有良好的應用前景。本文所建立的不確定度評定方法可用于TRFIA法測定大米中黃曲霉毒素B1含量結(jié)果的評定。

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