鎮(zhèn)艷　王華軍　易偉民

壓瘡是由于局部組織長(zhǎng)期受壓,血液循環(huán)障礙,局部組織營(yíng)養(yǎng)缺乏而致的軟組織潰爛和壞死。其防治是世界醫(yī)學(xué)的難題。及時(shí)減壓是預(yù)防壓瘡長(zhǎng)期以來(lái)的 “金標(biāo)準(zhǔn)”[1]。然而,組織缺氧產(chǎn)生的氧自由基會(huì)加重局部組織細(xì)胞和組織的損傷,也就是缺血再灌注損傷[2]。目前,大量研究表明缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning,IPC)和缺血后處理(ischemic postconditioning,I-postC)在臟器及骨骼肌的再灌注損傷中有顯著的保護(hù)作用[3],但關(guān)于IPC和I-postC及缺血聯(lián)合處理(ischemic preconditioning+ischemic postconditioning,IPC+I-postC)對(duì)壓瘡缺血再灌注損傷作用尚未見(jiàn)有報(bào)道,三種缺血處理方法參與壓瘡缺血再灌注性損傷的關(guān)系尚不清楚。本研究采用內(nèi)源性治療手段調(diào)節(jié)自身免疫技術(shù),通過(guò)動(dòng)物造模形成缺血再灌注性壓瘡,模擬臨床上IPC、I-postC及IPC+I-postC的干預(yù)方法,通過(guò)檢測(cè)壓瘡發(fā)生早期血清氧自由基的含量,闡明不同缺血處理方法在SD大鼠缺血再灌注損傷性壓瘡預(yù)防中的保護(hù)效果,探討IPC和I-postC及IPC+I-postC對(duì)壓瘡微循環(huán)缺血再灌注損傷是否同樣具有保護(hù)作用,比較三種缺血處理方法對(duì)SD大鼠皮膚及皮下組織在肉眼及血清氧自由基方面的損傷情況,探討氧自由基參與壓瘡發(fā)生的機(jī)理。為臨床壓瘡的預(yù)防和處理提更充分和科學(xué)依據(jù)。

材料與方法[4]

一、材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康雄性SD大鼠100只,SPF級(jí),體重220～250 g,中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,常規(guī)分籠飼養(yǎng)于安靜室溫環(huán)境,動(dòng)物在新環(huán)境中熟悉1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.主要儀器:BX50-OLYMPUS光學(xué)顯微鏡、離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、電子稱、HARRIS INC超低溫冰箱(-70℃)、空氣壓縮機(jī)、相機(jī)、外科手術(shù)器械一套。

3.主要試劑:磷鎢酸蘇木素染色試劑盒,NO測(cè)定試劑盒、MDA測(cè)定試劑盒、DAB顯色試劑盒、SOD測(cè)定試劑盒、4%戊二醛固定液、10%水合氯醛、4%多聚甲醛固定液、高錳酸鉀,草酸,Mallory磷鎢酸蘇木素染料,、ECL試劑盒心鈾,蛋白marker。

二、方法

1.壓瘡造模:在大鼠腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/kg劑量)進(jìn)行麻醉。減去腿部毛發(fā)約2 cm×2 cm的面積,暴露大腿股薄肌部位。將大鼠俯臥及固定四肢,將壓力接觸面垂直作用于大鼠大腿股薄肌處,連接空氣壓縮機(jī)與壓力汽缸,412.5 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)壓力下持續(xù)加壓2 h。見(jiàn)圖1-1。

2.動(dòng)物模型分組:將100只SD大鼠平均隨機(jī)分為5組,每組20只。(1)對(duì)照組(S組):用10%水合氯醛麻醉大鼠,2 h后處死取血。(2)缺血再灌注組(IR組):麻醉大鼠,將大鼠俯臥及固定四肢,持續(xù)施壓2 h,解壓2 h后處死取血。(3)預(yù)處理組(LPC組):麻醉大鼠,將大鼠俯臥及固定四肢,連續(xù)三個(gè)循環(huán)局部壓迫/解壓,每次10 min,然后再持續(xù)施壓2 h,解壓2 h后處死取血。(4)后處理組(I-postC組):麻醉大鼠,將大鼠俯臥及固定四肢,持續(xù)施壓2 h,解壓后即刻行連續(xù)三個(gè)循環(huán)局部壓迫/解壓,每次10 min,然后恢復(fù)血流灌注2 h后處死取血。(5)聯(lián)合處理組((IPC+I-postC組):麻醉大鼠,將大鼠俯臥及固定四肢,連續(xù)三個(gè)循環(huán)局部壓迫/解壓,每次10 min,然后再持續(xù)施壓2 h,解壓后即刻行連續(xù)三個(gè)循環(huán)局部壓迫/解壓,每次10 min,然后移開(kāi)壓力接觸面,血流恢復(fù)灌注2 h后處死取血。

圖1-1　大鼠壓瘡造模

圖1-2　大鼠造模出現(xiàn)的Ⅰ期壓瘡

3.肉眼觀察大鼠受壓部位皮膚壓瘡的發(fā)生率及分度:根據(jù)美國(guó)壓瘡學(xué)會(huì)最新的壓瘡分類標(biāo)準(zhǔn),通過(guò)肉眼觀察受壓部位皮膚顏色、形態(tài)學(xué)及完整性變化,將其分為Ⅰ度、Ⅱ度、Ⅲ度、Ⅳ度壓瘡[5]。

4.測(cè)定血清中SOD活力、MDA含量、NO含量:處死大鼠,取腹主動(dòng)脈3 mL血液置入Ep管中,經(jīng)3 600 r/min的速度離心10 min后取血清,-70℃冰箱保存待用。用722型分光光度計(jì),根據(jù)試劑盒操作規(guī)程分別采用氧化酶法檢測(cè)血清中超氧化物歧化酶(SOD)、硫代巴比妥酸染色法測(cè)丙二醛(MDA)、硝酸還原酶法測(cè)一氧化氮(NO)的水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)　　果

一、各組大鼠壓瘡發(fā)生情況

每組大鼠均未出現(xiàn)Ⅱ度及以上的壓瘡,但除S組外,其他各組局部皮膚肉眼觀察Ⅰ期壓瘡發(fā)生率均為100%。按α=0.05檢驗(yàn)水準(zhǔn),S組、IR組、IPC組、I-postC組及IPC+I-postC組壓瘡發(fā)生的總體分布不同或不全相同。兩兩比較發(fā)現(xiàn),按α′=0.008檢驗(yàn)水準(zhǔn),S組與其它各組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,除S組外,IR組、IPC組、I-postC組、IPC+I-postC組兩兩比較的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、各組大鼠壓瘡發(fā)生率比較

兩兩比較發(fā)現(xiàn),按α′=0.008檢驗(yàn)水準(zhǔn),S組與其它各組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,除S組外,IR組、IPC組、I-postC組、IPC+I-postC組兩兩比較的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1　5組大鼠受壓部位皮膚壓瘡發(fā)生率兩兩比較(α′=0.05/6=0.008)

注:S組為對(duì)照組,IR組為缺血再灌注組,LPC組為預(yù)處理組,I-postC組為后處理組,IPC +I-postC組為聯(lián)合處理組

三、各組壓瘡大鼠血清中SOD活力、MDA和NO的水平

對(duì)每組大鼠血清中SOD活力、MDA和NO的含量比較發(fā)現(xiàn),按α′=0.008檢驗(yàn)水準(zhǔn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2　5組大鼠血清SOD活力、MDA、NO

注:S組為對(duì)照組,IR組為缺血再灌注組,LPC組為預(yù)處理組,I-postC組為后處理組,IPC +I-postC組為聯(lián)合處理組;SOD為氧化酶法檢測(cè)血清中超氧化物歧化酶,MDA為硫代巴比妥酸染色法測(cè)丙二醛,NO為硝酸還原酶法測(cè)一氧化氮;各組比較：P<0.05

討　　論

壓瘡的預(yù)防重于治療,大多數(shù)壓瘡臨床上是可以預(yù)防的,當(dāng)人體的皮膚通過(guò)自身調(diào)整提高了局部壓力耐受性[6],沒(méi)有及時(shí)翻身的長(zhǎng)期臥床病人也不會(huì)發(fā)生壓瘡。Barry Golden以豬建立壓瘡模型發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間受壓后組織可出現(xiàn)一定的適應(yīng)性[7]。通過(guò)反復(fù)短暫的壓力刺激,延長(zhǎng)間隔翻身時(shí)間,可促進(jìn)了毛細(xì)血管的開(kāi)放和增生,增強(qiáng)皮膚毛細(xì)血管承受壓力的能力[8]。以上研究為缺血再灌注性壓瘡早期處理提供了一定的理論基礎(chǔ)。缺血處理通過(guò)輕度的缺血應(yīng)激作用激活,調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制,從而加強(qiáng)皮膚及皮下組織對(duì)缺血再灌注損傷的抵抗力[9]。

本研究結(jié)果顯示,IPC組與其他各組比較,MDA、NO含量稍高于S組,低于IR組,SOD活性低于S組,高于RI組;兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說(shuō)明LPC可能通過(guò)減輕缺血后微血管床的閉塞對(duì)血管進(jìn)行保護(hù),也可能與IPC可緩解缺血再灌損傷引起的組織中高氧狀態(tài)有關(guān)。

研究表明[10-11],IPC產(chǎn)生的少量自由基可啟動(dòng)內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制,減少在缺血再灌注過(guò)程中因線粒體受損大量自由基的產(chǎn)生,減輕對(duì)機(jī)體組織氧化應(yīng)激損傷,從而保護(hù)了缺血組織,有效緩解了壓瘡缺血再灌注性損傷,為臨床壓瘡的防護(hù)提供了可靠的理論依據(jù)。

研究表明,缺血后處理也是一種有效的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制,與缺血預(yù)處理具有類似的作用[12]。其面對(duì)的是已缺血組織,是從建立一種更有效的再灌注角度出發(fā),旨在處理和挽救己缺血組織,最大程度的減輕再灌注損傷,對(duì)減少缺血氧自由基的生成方面具有重要的聯(lián)系。I-postC相比IPC,因作用于再灌注過(guò)程,避免了缺血發(fā)生的不可預(yù)知性,在臨床中的運(yùn)用更具有價(jià)值。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)I-post組與其他各組兩兩比較,SOD活性、NO、MDA含量稍低于S組,高于IR組,I-post組與S組、I-post組與RI組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,I-post組與LPC組、I-post組與LPC+I-post組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;這些數(shù)據(jù)說(shuō)明,在I-post組實(shí)驗(yàn)血清氧自由基的含量顯著低于IR實(shí)驗(yàn)組。此現(xiàn)象說(shuō)明,通過(guò)I-post組的保護(hù)作用可有效減輕壓瘡缺血再灌注損傷,缺血后處理可以減輕氧自由基的爆發(fā)產(chǎn)生。

本研究中,5組實(shí)驗(yàn)大鼠血清中SOD活性均高于RI組,MDA、NO的含量均低于RI組,說(shuō)明在肢體受壓后有大量的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物和氧自由基產(chǎn)生,血清中SOD活力和MDA含量存在負(fù)性相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)證明,再灌注損傷導(dǎo)致的氧自由基的損傷是可以干預(yù)的,從而提示我們可以從減輕組織自由基損傷的角度預(yù)防缺氧再灌注損傷對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的破壞。與RI組比較,IPC組、I-postC組和IPC+I-postC組血清MDA、NO含量明顯降低,SOD活性明顯增高(P<0.05)。IPC組與I-postC組、I-postC組與IPC+I-postC組的氧自由基的指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,RI組、IPC組、I-postC組和IPC+I-postC組的MDA、NO含量均明顯高于S組,SOD活性顯著低于S組。說(shuō)明除S組外,其他四組均存在缺血再灌注損傷。血清中NO的較對(duì)照組顯著增高,這可能與在缺血再灌注期,組織內(nèi)可爆發(fā)生成大量的超氧陰離子自由基,而導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞其它成分發(fā)生氧化損傷有關(guān)。

總之,缺血處理在壓瘡的形成過(guò)程中起到重要作用,且IPC組、I-postC組和IPC+I-postC組三種缺血處理方法具有近似等同的效果,均對(duì)大鼠缺血再灌注損傷性壓瘡具有保護(hù)作用。

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