王少珍　廖聯(lián)明

黃藥子為薯蕷科植物黃獨(dioscorea bublifera L,DB)的干燥塊莖,廣泛分布于亞洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)。作為傳統(tǒng)中藥,它被廣泛用于治療喉痛、甲狀腺腫和甲狀腺瘤。此外,印度和巴西還將黃藥子用于治療糖尿病[1-2],孟加拉國北部地區(qū)將其用于麻風病[3]。黃藥子雖具有獨特的療效,但在過去30多年里,因長期和大量服用黃藥子及其制劑而出現(xiàn)肝損害的病例屢見報道[4-5],大大限制了黃藥子的臨床應用。由于黃藥子在機體內(nèi)的作用機制尚不明確,故對其解毒藥物的選擇仍存在較大爭議。如阿魏酸[6]和黃芩素[7]可通過抑制核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號通路,提高機體的抗氧化能力,緩解炎癥反應,從而保護黃藥子毒性成分黃毒素B誘導的肝損傷;甘草可通過提高細胞色素450酶(cytochrome P 450,CYP450酶)活性,抑制CYP2E1、CYP3A4的mRNA表達,從而預防黃藥子對肝臟的損害作用[8];黃芩和黃柏配伍后可通過提高肝臟的谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平和抗氧化水平,減少肝組織細胞損傷,從而達到保肝的效果[9]。近年來,新一代測序技術的出現(xiàn)實現(xiàn)了高通量序列測定和測序成本降低,并大大提高了新基因或新生物標志物的識別速度和效率[10-12]。數(shù)字化基因表達(digital gene expression,DGE)是一個基于reads的轉錄組測序技術,可用于基因表達的定量分析,且在允許少量偏差存在的情況下實現(xiàn)基因表達譜的比較分析,從而提高了轉錄組測序的靈敏性和準確性[13-14]。由于小鼠的全基因組序列測定已完成,利用小鼠進行分子水平相關研究有很大的優(yōu)勢[15]。目前DGE技術已被廣泛地用于藥物肝毒性作用機制的研究,如Chen等[16]通過DGE分析發(fā)現(xiàn),偏苯三酸三辛酯(trioctyl trimellitate,TOTM)誘導的小鼠肝損傷涉及細胞周期調節(jié)相關通路、脂質代謝通路和氧化應激系統(tǒng)。本研究中,筆者采用黃藥子水提取物誘導小鼠肝損傷,利用從肝臟中提取的總核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)建立DGE文庫,通過對比正常組DGE文庫,將差異表達基因進行基因本體論(gene ontology,GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析,以期通過對黃藥子誘導的肝臟相關差異表達基因的分析,了解黃藥子致肝毒性的作用機制,為尋找更高效的解毒藥物提供參考信息。

資料與方法

一、實驗動物與材料

1.實驗動物:SPF級雌性[17]昆明小鼠40只,4～6周齡,體重(20±2)g,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司(合格證編號2015000533474),常規(guī)飼養(yǎng)在福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF飼養(yǎng)室。所有動物實驗均遵循實驗動物倫理要求,并獲得倫理委員會的批準。

2.主要試劑:黃藥子飲片(江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司,生產(chǎn)批號:1609004);TRIzol試劑(美國Invitrogen,15596018)、焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)處理水(美國Solarbio,R1600)、蘇木素染色液(美國Solarbio,G1140)和伊紅染色液(美國Solarbio,G1100)。

3.主要實驗儀器:AU 2700全自動生化分析儀(日本OLYMPUSA公司)、旋轉蒸發(fā)儀RE-52(上海亞榮生化儀器廠)、可見分光光度計(美國Thermo公司)、高速冷凍離心機(德國Eppedndorf公司)和RM2235組織切片機(德國徠卡公司)、HiSeqTM 2000 測序儀(Illummina公司)。

4.主要分析軟件:用于比對分析的STAR 2.5.1b;用于定量分析的HTSeq 0.6.0、featureCounts 1.5.0和RSEM 1.2.28;用于差異分析的DESeq 2 1.10.1和edgeR 3.12.1;用于富集分析的clusterProfiler 3.0.5;用于可變剪接分析的rMATS 3.2.1;用于變異分析的GATK 3.2.1和snpEff 4.2;用于融合基因發(fā)現(xiàn)的SOAPfuse 1.27和star-fusion 0.7.0。

二、方法

1.藥物制備:參考文獻[18],取干燥黃藥子飲片400 g,搗碎后按體積加入10倍量水,室溫浸泡120 min,然后于水浴鍋中100℃回流提取60 min,濾過。濾渣加8倍量水繼續(xù)提取1次,合并兩次濾液。將混合液在1 000 r/min下離心20 min,傾出上清液至干凈瓶中,于(45±5)℃下真空減壓濃縮至含生藥量1.2 g/mL。濃縮液置4℃保存,備用。

2.實驗動物分組與建模:將40只實驗小鼠按隨機數(shù)字表法分成4組:對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組,每組10只。每組小鼠連續(xù)灌胃給藥21 d。低、中、高劑量組黃藥子提取物濃縮液的每日給藥量分別相當于臨床成人日薦最高劑量(15 g)的2倍、4倍和8倍,即6 g/kg、12 g/kg和24 g/kg;對照組給予相同體積純水。末次給藥后,小鼠禁食不禁水。

三、觀察指標

1.小鼠體重增長值:實驗期間,各組小鼠每隔3 d 稱重一次,末次給藥的次日再次稱重。依據(jù)首末次稱重體重計算小鼠體重增長值,計算公式為:

小鼠體重增長值(g)=末次稱量體重(g)-首次稱量體重(g)(1)

2.血清生化指標檢測:末次稱重后,眼球采血,置1.5 mL EP管中,室溫下靜置2 h后,于4℃離心機中3 000 r/m離心20 min,吸取上清液轉移到新的EP管中,置冰盒中送至福建省第二人民醫(yī)院檢驗科,采用全自動生化分析儀檢測各組小鼠血清中的丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)的活性。

3.肝臟指數(shù):各組小鼠眼球采血后以脫頸椎法處死,迅速完整地剖取小鼠肝臟,稱量小鼠肝濕重。計算給藥期間各組小鼠的肝臟指數(shù),計算公式為:

肝臟指數(shù)=肝臟重量(g)/末次稱量體重(g)×100%(2)

4.肝組織的形態(tài)變化:肝臟稱重后剪取肝左葉投入到4%多聚甲醛內(nèi)固定36 h后,用自來水漂洗至無甲醛味,自肝左葉距邊緣5 mm處修剪0.5 cm×0.5cm×1cm的組織塊,經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、HE染色后,于普通光鏡下觀察小鼠的肝組織形態(tài)學變化,并于200×視野下攝取圖像。

5.DGE文庫信息分析

(1)RNA提取、建庫和測序:肝臟稱重后取肝小葉迅速置于液氮中速凍,放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)試劑盒廠家說明書,采用Trizol提取小鼠肝臟總RNA,經(jīng)紫外分光光度計檢測樣本中的RNA質量合格后,寄往北京諾禾致源生物有限公司進行測序。樣品檢測合格后,用帶有多聚胸腺嘧啶寡核苷酸[Oligo(dT)]的磁珠富集原核生物帶有polyA尾的信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)。隨后在NEB Fragmentation Buffer中用二價陽離子將得到的mRNA隨機打斷。以片段化的mRNA為模版,隨機寡核苷酸為引物,在M-MuLV逆轉錄酶體系中合成互補脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid,cDNA)第一條鏈,隨后用核糖核酸酶H(ribonuclease H,RNaseH)降解RNA鏈,并在脫氧核糖核酸聚合酶Ⅰ(deoxyribonucleic acidpolymeraseⅠ,DNApolymerase Ⅰ)體系下,以三磷酸脫氧核糖核苷酸(deoxy-ribonucleotide triphosphates,dNTPs)為原料合成cDNA第二條鏈,隨后利用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)過末端修復、加A尾并連接測序接頭,用AMPure XP beads篩選200bp左右的cDNA,進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增,并再次使用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物,最終獲得文庫。

文庫構建完成后,先使用Qubit 2.0進行初步定量,稀釋文庫至1ng/μl,隨后使用Agilent 2100對文庫的插入片段進行檢測,插入片段符合預期后,使用定量實時聚合酶鏈鎖反應(quantitative real time polymerase chain reaction,Q-PCR)方法對文庫的有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度>2nM),以保證文庫質量。文庫質檢合格后,使用HiSeqTM 2000 測序儀進行測序。

(2)質控分析:經(jīng)測序錯誤率檢查、鳥嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸(guanine nucleotide and cytosine nucleotides,GC)含量分布檢查及原始測序數(shù)據(jù)過濾,剔除帶有接頭、帶有N堿基和測序質量低的reads,獲得clean reads以供后續(xù)分析。采用STAR軟件將獲得的clean reads對比到基因組或轉錄組中,根據(jù)比對結果,分別統(tǒng)計reads在基因組外顯子區(qū)域、內(nèi)含子區(qū)域以及基因間區(qū)所占的比例,最后使用HTSeq進行基因水平的定量分析,用公式計算基因表達水平:

RPKM:RPKM=106R:(NL/103)(3)

設RPKM(A)為基因A的表達量,則R為唯一比對到基因A的reads數(shù),N為比對到唯一參考基因的總reads數(shù),L為基因A的堿基數(shù)[19]。

(3)差異表達基因的篩選:篩選2個DGE文庫,即對照組(Normal組)和高劑量組(DB誘導組),分析差異表達基因,對差異檢驗的P值作多重假設檢驗校正,padj為多重假設檢驗校正后的P值。采用edgeR軟件進行表達差異顯著性分析,以padj<0.05,差異倍數(shù)(foldchange)的絕對值>2作為差異有統(tǒng)計學意義的標準。padj值越小,差異倍數(shù)越大,表明基因表達水平差異越顯著。當log2(foldchange)≥1 時,表示該基因表達上調;log2(foldchange)≤-1時,表示下調表達;當|log2(foldchange)<1| 時,表示基因表達差異無統(tǒng)計學意義。采用火山圖、文氏圖(Venndiagram)等方式展示差異表達基因。

(4)GO功能富集和KEGG(http://www.kegg.jp/)富集分析:使用clusterProfiler 3.0.5 軟件對2個DGE文庫篩選出的差異表達基因進行GO功能富集分析,將差異表達基因映射到相應條目,計算每個條目的差異表達基因數(shù)目。再使用KEGG通路富集對基因涉及的通路進行聚類,獲得差異表達基因所參與的主要通路。

四、統(tǒng)計學分析

結　　果

一、不同劑量黃藥子對小鼠體重增長值和肝臟指數(shù)的影響

與對照組相比,低劑量組和中劑量組小鼠的體重增長、肝臟指數(shù)的差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05);高劑量組小鼠的體重增長值降低,肝臟指數(shù)增高,差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見圖1,2。

二、不同劑量黃藥子對小鼠血清中ALT和AST酶活性的影響

各給藥小鼠血清中的ALT和AST酶活性均高于對照組,且兩種酶的活性變化呈劑量依賴性,即隨著黃藥子給藥劑量的升高而增強。相比對照組,中、高劑量組小鼠ALT酶活性的變化均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05),但只有高劑量組的AST酶活性變化差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

注:低、中、高劑量組黃藥子提取物濃縮液的每日給藥量分別為6g/kg、12g/kg和24g/kg,對照組給予同體積純水;與對照組比較,**P<0.05

圖1不同劑量黃藥子灌胃對小鼠體重增長值的影響

注:低、中、高劑量組黃藥子提取物濃縮液的每日給藥量分別為6g/kg、12g/kg和24g/kg,對照組給予同體積純水;與對照組比較,**P<0.05

圖2不同劑量黃藥子灌胃對小鼠肝臟指數(shù)的影響

注:ALT為丙氨酸氨基轉移酶,AST為天冬氨酸轉氨酶;低、中、高劑量組黃藥子提取物濃縮液的每日給藥量分別為6g/kg、12g/kg和24g/kg,對照組給予同體積純水;與對照組比較:**P<0.05

圖3不同劑量黃藥子灌胃對小鼠血清ALT和AST酶活性的影響

三、不同劑量黃藥子對小鼠肝組織形態(tài)變化的影響

肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列,肝索排列整齊,肝小葉結構正常,細胞核明顯,肝臟未見肝臟病理改變(圖4a)。與圖1相比,肝小葉結構正常,肝索排列較整齊,細胞核較明顯,較接近對照組,但見匯管區(qū)有少量炎性細胞浸潤(圖4b)。個別細胞發(fā)生腫脹,匯管周圍散在大量點灶狀肝細胞壞死(圖4c)。肝組織的正常結構明顯被破壞,肝索受壓紊亂,肝細胞明顯腫大(胞漿疏松化),呈氣球樣變性,小葉內(nèi)有較多中性粒細胞浸潤(圖4d)。

注:a為對照組,b為低劑量組,c為中劑量組,d為高劑量組;低、中、高劑量組黃藥子提取物濃縮液的每日給藥量分別為6 g/kg、12 g/kg和24 g/kg,對照組給予同體積純水

圖4不同劑量黃藥子灌胃對小鼠肝組織形態(tài)學變化的影響(HE染色,×200)

四、DEG文庫分析結果

(一)DEG文庫質量分析

對Normal組和DB誘導組小鼠的肝臟RNA進行轉錄組測序(RNA-sequencing,RNA-Seq)測序與分析,從構建的2個DGE文庫中分別檢測出13 214 893和11 124 617條堿基序列(raw reads)。去除帶接頭(adaptor related)、帶N堿基(containing N)和測序質量低(low quality)的reads后,2個文庫分別得到12 819 933和10 786 300條序列(clean reads)。將clean reads比對到基因組或轉錄組是后續(xù)分析的基礎。采用STAR軟件對RNA-seq測序數(shù)據(jù)進行比對分析,將clean Reads 分別比對到參考基因和參考基因組。唯一匹配比對的reads在80%以上,證明RNA-Seq的測序質量較好。

使用皮爾遜相關系數(shù)(Pearson coefficient)分析樣品間基因表達水平相關性,這是檢驗實驗可靠性和樣本選擇是否的重要指標。結果顯示,Normal組和DB誘導組兩樣本間的相關系數(shù)為0.975,大于理想的理論值0.92,說明樣本間的差異較小,測序數(shù)據(jù)可靠,可用于下一步分析。

(二)基因組不同區(qū)域分布情況

已知物種是昆明小鼠,為了解測序reads在基因組上的比對情況,分別統(tǒng)計reads在基因組外顯子區(qū)域、內(nèi)含子區(qū)域以及基因間區(qū)所占的比例。結果顯示,Normal組reads在基因組外顯子區(qū)域、內(nèi)含子區(qū)域以及基因間區(qū)所占的比例分別為93.13%、4.51%和2.36%,DB組分別為93.36%、4.5%和2.14%。其比對到外顯子區(qū)域的比例最高,說明物種的基因注釋較為完善,僅有少量前體mRNA或可變剪接事件滯留的內(nèi)含子,非編碼核糖核酸(non-coding ribonucleic acid,ncRNA)或少許脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)片段污染小。

(三)差異表達基因的聚類分析

如圖5(a)所示,根據(jù)2個DGE文庫中基因表達的比較結果,以padj<0.05為標準,篩選出了312個顯著差異表達的基因,DB誘導組與Normal組比,表達顯著上調基因(UP)和下調基因(DOWN)個數(shù)較接近,分別為148個和164個。提示這些差異表達基因可能對黃藥子水提取物誘導的小鼠肝損傷具有重要影響。將所有表達基因按DB組和Normal組劃分后,結果如圖5(b)所示,DB組和Normal組均表達的高質量序列有9537個,僅在DB組表達的有702個,僅在Nomal組表達的有539個?？梢婞S藥子的誘導作用嚴重影響了小鼠肝臟的相關功能基因的表達。

(四)顯著差異表達基因的GO功能分析

DB組和Noma組DGE文庫中差異表達基因經(jīng)功能注釋后主要歸類為生物學過程和分子功能兩個條目。生物學過程涉及的GO種類更多,各種類中的基因數(shù)也相對較均衡,其中含較多基因的為甲烷單加氧酶活性、血紅素結合過程、四吡咯結合過程和氧化還原酶活性等生物功能;分子功能中含相對較多基因的為一元羧酸代謝過程、脂肪酸代謝過程、先天免疫反應和細胞因子反應過程等。見表1。

注:a為差異基因聚類火山圖。紅色區(qū)域表示基因上調表達,綠色區(qū)域表示基因下調表達,藍色區(qū)域正常表達結果。b差異基因聚類Venn圖

圖5　正常對照組與黃藥子誘導組小鼠的差異基因聚類分析

GO功能GOIDpadj基因數(shù)GO分支分子功能GO:00044970.00000017甲烷單加氧酶活性monooxygenaseactivityGO:00200370.00000016血紅素結合過程hemebindingGO:00469060.00000016四吡咯結合過程tetrapyrrolebindingGO:00083950.00000710類固醇羥化酶活性steroidhydroxylaseactivityGO:00040270.0000088酒精性磺基轉移酶活性alcoholsulfotransferaseactivityGO:00167050.00001016氧化還原酶活性oxidoreductaseactivityGO:00081460.0000238磺基轉移酶活性sulfotransferaseactivityGO:00083910.0000238花生四烯酸單氧酶活性arachidonicacidmonooxygenaseactivityGO:00055060.00002313鐵離子結合過程ironionbindingGO:00015170.0000237N-乙酰氨基葡糖活性N-acetylglucosamineactivityGO:00043940.0000237硫酸乙酰肝素-2-O-磺基轉移酶活性heparansulfate-2-O-sulfotransferaseactivityGO:00162320.0000237HNK-1-磺基轉移酶活性HNK-1sulfotransferaseactivityGO:00170950.0000237硫酸乙酰肝素-6-O-磺基轉移酶活性heparansulfate6-O-sulfotransferaseactivityGO:00187210.0000237反式-9R,10R-二氫菲二醇磺基轉移酶活性trans-9R,10R-dihydrodiolphenanthrenesulfotransferaseactivityGO:00187220.00002371-鄰二氮菲磺基轉移酶活性1-phenanthrolsulfotransferaseactivityGO:00187230.00002373-鄰二氮菲磺基轉移酶活性3-phenanthrolsulfotransferaseactivityGO:00187240.00002374-鄰二氮菲磺基轉移酶活性4-phenanthrolsulfotransferaseactivityGO:00187250.0000237反式-3,4-二氫菲二醇磺基轉移酶活性trans-3,4-dihydrodiolphenanthrenesulfotransferaseactivityGO:00187260.00002379-鄰二氮菲磺基轉移酶活性9-phenanthrolsulfotransferaseactivityGO:00187270.00002372-鄰二氮菲磺基轉移酶活性2-phenanthrolsulfotransferaseactivityGO:00191110.0000237鄰二氮菲磺基轉移酶活性phenanthrolsulfotransferaseactivityGO:00349300.00002371-鄰二氮菲磺基轉移酶活性1-hydroxypyrenesulfotransferaseactivityGO:00506980.0000237蛋白多糖磺基轉移酶活性proteoglycansulfotransferaseactivityGO:00519220.0000237膽固醇磺基轉移酶活性cholesterolsulfotransferaseactivity

GO功能GOIDpadj基因數(shù)GO分支分子功能GO:00506940.0000287半乳糖-3-O-磺基轉移酶活性galactose3-O-sulfotransferaseactivityGO:00015370.0000347N-乙酰半乳糖胺-4-O-磺基轉移酶活性N-acetylgalactosamine4-O-sulfotransferaseactivityGO:00167820.0001318磺酸基轉移酶活性transferaseactivity,transferringsulfur-containinggroupsGO:00083920.0001317花生四烯酸表氧化酶活性arachidonicacidepoxygenaseactivityGO:00167120.0003957氧化還原酶活性oxidoreductaseactivityGO:00043640.0026475谷胱甘肽轉移酶活性glutathionetransferaseactivityGO:00703300.0026475芳香酶活性aromataseactivityGO:00198250.0048746氧化結合過程oxygenbindingGO:00055040.0055845脂肪酸結合過程fattyacidbindingGO:00332930.0063956一元羧酸結合過程monocarboxylicacidbindingGO:00167090.0080145氧化還原酶活性oxidoreductaseactivityGO:00047450.0288053視黃醇脫氫酶活性retinoldehydrogenaseactivityGO:00308810.0288053β2-微球蛋白結合過程beta-2-microglobulinbindingGO:00010780.0318897轉錄抑制因子活性transcriptionalrepressoractivityGO:19016810.03303310磺酸化合物結合過程sulfurcompoundbindingGO:00162900.0330333棕櫚酰輔酶a水解酶活性palmitoyl-CoAhydrolaseactivityGO:00019480.0333667糖蛋白結合過程glycoproteinbindingGO:00380240.0356065貨物受體活性cargoreceptoractivityGO:00167650.0445515烷基或芳基轉移酶活性transferaseactivity,transferringalkyloraryl(otherthanmethyl)groups

注：geneID為注釋到GO編號上的差異基因的ID；padj為矯正后的P-Value，一般情況下，Corrected_pValue<0.05該功能為顯著富集項；基因數(shù)：差異基因中與該通路相關的基因數(shù)

(五)顯著差異表達基因的KEGG通路分析

為確定這些差異表達基因所參與的生物代謝通路和信號轉導途徑,利用KEGG數(shù)據(jù)庫進行富集。結果顯示,這些差異表達基因所參與的生物學通路總數(shù)為140條,其中顯著富集通路有8條。統(tǒng)計這8條顯著富集的通路,以及參與這些通路的差異表達基因。其中,視黃醇代謝通路、花生四烯酸代謝通路、過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路、不飽和脂肪酸的生物合成過程均涉及脂質代謝。此外,除了谷胱甘肽代謝通路和不飽和脂肪酸的生物合成通路外,均有細胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)酶系的參與。因此可以確定黃藥子致肝損傷與脂類、CYP450酶系、谷胱甘肽代謝息息相關。見表2。

表2　正常對照組與黃藥子誘導組小鼠差異表達基因最顯著富集的KEGG通路統(tǒng)計表

討　　論

黃藥子為臨床常用中藥,近年來,雖然其所致的肝損傷引起了廣泛的關注,但相關的物質基礎和毒性作用機制尚不明確。在本研究中,首先用不同劑量的黃藥子水提取物誘導小鼠肝損傷,通過評估各組小鼠體重變化、肝臟指數(shù)、血清生化指標ALT和AST酶活性以及肝組織形態(tài)學變化,明確了可導致明顯肝損傷的給藥劑量。最后對DB誘導組和正常對照組小鼠的DGE文庫進行比較分析,確定黃藥子致肝損害涉及的代謝通路。

與對照組相比,只有高劑量組小鼠的體重增長值、肝臟指數(shù)差異具有統(tǒng)計學意義。該結果顯示,以高劑量黃藥子水提取物灌胃可能誘導了小鼠肝損傷,導致肝臟腫大。圖3中與對照組相比,同樣僅高劑量組小鼠的ALT和AST酶活性變化具有統(tǒng)計學意義,中劑量組僅有ALT酶活性變化差異有統(tǒng)計學意義。從組織形態(tài)學分析結果來看,黃藥子所致肝損害的病理變化程度呈劑量依賴性,即給藥劑量越高,肝組織病理變化越顯著,其中高劑量組的病變程度最顯著。經(jīng)綜合分析,在給定的實驗期間,只有高劑量黃藥子水提取物灌胃才會導致小鼠出現(xiàn)明顯的肝損傷。

在后續(xù)研究中分別用從對照組(Normal組)和高劑量組(DB組)小鼠的肝臟中提取的總RNA建立了cDNA文庫并測序對比。結果發(fā)現(xiàn)DB組和Normal組的高質量reads都大于108個,唯一匹配比對的reads的百分比>80%。經(jīng)定量分析,相比Normal組DGE文庫,DB組的DGE文庫中有148個基因表達上調,164基因表達下調。經(jīng)GO功能分析和KGEE通路分析,發(fā)現(xiàn)有8條顯著富集的通路。根據(jù)兩組差異表達基因的功能注釋歸類推測,黃藥子可通過引起生物分子的代謝紊亂而導致肝損傷,其原因可能是黃藥子或其代謝產(chǎn)物直接參與了肝臟的生物大分子的生物學過程,如氧化還原反應,或通過影響相應酶的活性而間接使各生物代謝過程受到影響;而兩組顯著差異表達基因富集的視黃醇代謝通路、花生四烯酸代謝通路、PPARs信號通路以及不飽和脂肪酸的生物合成過程均涉及脂質代謝,且除谷胱甘肽代謝通路和不飽和脂肪酸的生物合成通路外,均有CYP450酶系的參與,因此可以確定黃藥子致肝損傷可能與脂質、CYP450酶以及谷胱甘肽的生物過程息息相關。

PPARs對脂肪酸的轉運和氧化、膽固醇的分解代謝以及脂肪的轉運具有調控作用,是維持脂類代謝穩(wěn)態(tài)的重要調節(jié)因子[20]。PPARs與配體結合激活后,可與靶基因啟動區(qū)域的過氧化物酶增值物反應元件結合,從而影響脂質的分解代謝過程,如調整過氧化物酶活性、線粒體脂肪酸的β氧化和脂肪酸的攝取等[21-22]。本研究與對照組的比較結果中,DB組有多個與PPARs信號通路相關的基因表達顯著上調,如CYP450酶4a亞型(Cyp4a12a、Cyp4a14、Cyp4a10、Cyp4a12b)、Cd36和硬脂酰-輔酶A去飽和酶2(stearoyl-CoA desaturase2,Scd2)。CYP450酶4a亞型可促進ω不飽和脂肪酸的氧化;Cd36是B類清道夫受體家族的一種多功能糖蛋白,可促進血循環(huán)中的脂肪酸異常轉運至肝細胞內(nèi),導致肝臟內(nèi)脂質異常積聚[23];Scd2也在不飽和脂肪酸的生物合成過程中起著重要的調節(jié)作用,是飽和長鏈脂肪酸轉化為多不飽和脂肪酸的速率限制酶[24]。本研究中,BD組Scd2表達顯著上調,可能使得脂類代謝異常。因此黃藥子水提取物可通過上調CYP450酶4a亞型、Cd36、Scd2基因表達,使小鼠的脂類代謝的穩(wěn)態(tài)失衡,引起肝內(nèi)脂肪蓄積,并增強肝臟的脂肪酸氧化反應,從而導致肝損傷。

CYP450酶系是最重要的藥物代謝酶系統(tǒng)之一,在許多外源性生物(如臨床常用藥物、有毒化學物質、致癌物和環(huán)境污染物)和內(nèi)源性化合物(如脂肪酸、膽汁酸和前列腺素)的生物轉化起著關鍵性作用[25-26]。人體內(nèi)90%以上的藥物代謝是由CYP450酶介導的,CYP1a2、CYP2a6、CYP2e1和CYP3a44等CYP450酶亞型具有促進大多數(shù)臨床藥物生物轉化的作用[27]。肝臟是機體最大的代謝器官,大多數(shù)藥物進入體內(nèi)后會在肝臟內(nèi)被分解成小分子物質,在肝臟中也含有十分豐富的CYP450酶。與肝內(nèi)CYP450酶有關的藥物毒性形成機制主要有3種:(1)藥物在肝內(nèi)經(jīng) CYP450 酶代謝后,會產(chǎn)生一些親電子基、自由基的代謝產(chǎn)物,這些代謝產(chǎn)物與細胞膜或其它細胞成分發(fā)生化學反應,引起脂質過氧化,最終導致肝細胞壞死;(2)藥物的代謝產(chǎn)物可與DNA及各種蛋白質分子結合,誘導自身抗體生成,引起免疫病理損傷;(3)由于未代謝的藥物蓄積導致代謝該藥物的CYP450亞型活性降低,使藥物無法被轉變?yōu)闊o毒性的代謝產(chǎn)物,導致肝損傷。如表2所示,在經(jīng)KEGG富集的CYP450酶代謝通路、CYP450酶催化的外源物質代謝通路中,DB組CYP450酶超級家族的Cyp2e1、Cyp3a44亞型基因表達顯著上調,這與前期的研究結果相一致[28-29]。此外,CYP450酶的下游基因,谷胱甘肽轉移酶(glutathione S-transferase,Gst)表達顯著上調。這表明了黃藥子水提取物可能會誘導CYP2e1和CYP3a44酶的活性,產(chǎn)生帶有自由基的代謝產(chǎn)物,從而破壞機體氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)的平衡。因此,黃藥子的肝毒性形成的作用機制可能為上述的機制(1)。

谷胱甘肽是最常見的抗氧劑和自由基清除劑,Gst和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,Gpx)是與谷胱甘肽相關的抗氧酶。Gst可催化氧化應激反應過程中的親電子化合物與谷胱甘肽結合,而Gpx具有將谷胱甘肽作為供電基團,清除自由基及其衍生物,減少脂質過氧化物的形成,增強機體抗氧化能力的作用。在表2的谷胱甘肽代謝通路中,Gpx基因表達顯著下調,機體抗氧化應激能力減弱。由此證明,黃藥子水提取物經(jīng)代謝后可能會產(chǎn)生一些氧自由基,增加機體的氧化應激損傷,從而損害小鼠肝臟。

綜述所述,黃藥子在肝內(nèi)經(jīng)CYP450酶代謝后,產(chǎn)生帶有自由基的代謝產(chǎn)物,使胞質膜和細胞器的脂質過氧化,同時減弱機體的抗氧化能力;黃藥子還可通過影響肝內(nèi)脂質代謝、增強肝臟脂肪酸氧化反應致肝損傷。通過本研究促進了對黃藥子致肝損傷的分子作用機制的認識,在后續(xù)的研究中,我們將對相關基因進行一一驗證。由于小鼠與人類同源共享一套保守基因序列,因此可通過黃藥子誘導小鼠肝毒性的作用機制來解釋黃藥子引起臨床肝損害不良反應的原因,并為尋找有效的臨床解毒物質提供理論依據(jù)。

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