陳超　楊煉紅

炎癥反應是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個病理過程,小膠質(zhì)細胞是其主要的免疫監(jiān)視細胞。小膠質(zhì)細胞的過度活化,使特定的炎癥因子增多,從而導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1-2]。免疫異常是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要原因之一。脂多糖(Lipopolysacchairde,LPS)是革蘭氏陰性細菌的細胞壁成分之一,是常用的小膠質(zhì)細胞激活劑。當小膠質(zhì)細胞被脂多糖激活后將釋放大量的炎癥介質(zhì),如白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α),從而導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生[3-4]。因此,抑制小膠質(zhì)細胞的活化,減少炎癥因子的分泌,將成為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病的一種方法。正常條件下,Toll樣受體(TLRs)在腦細胞內(nèi)表達量很低,當在細胞受到損傷時TLRs表達迅速增加,并作用于下游信號分子,使編碼炎癥的相關(guān)分子及細胞因子的基因轉(zhuǎn)錄[5-6]。其中TLR4在小膠質(zhì)細胞的激活及炎癥誘導中起重要作用。TAK-242是TLR4受體的特異性抑制劑[7]。本實驗通過脂多糖處理BV2細胞構(gòu)建炎癥細胞模型,并使用TAK-242預處理細胞,觀察TLR4信號通路炎癥因子的變化。

材料與方法

一、材料

BV2細胞株為本實驗室劉軍教授所贈、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS、胰酶、雙抗均購自美國Glibco公司;脂多糖購自美國Sigma公司;TAK-242購自美國MCE公司;CCK-8試劑盒購自日本同仁公司;Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT Master Mix和PCR擴增試劑SYBR Premix Ex Taq Ⅱ購于日本Takara公司;引物為華大基因合成,序列如下:TLR4 上游序列：5′-GGCACTGCATGTGACTTTCC-3′；TLR4下游序列：5′-CTCAGACTCGGCACTTAGCA -3′。MyD88上游序列：5′-CTGGCCTGAGCAACT AGGAC-3′；MyD88下游序列：5′-CGAGGAGGCATG TGTGTACT-3′。IL-1β上游序列：5′-AGAGCCCAT CCTCTGTGACT-3′；IL-1β下游序列：5′-GGAGCCT GTAGTGCAGTTGT-3′。IL-6上游序列：5′-CTGGT CTTCTGGAGTACCATAGC-3′；IL-6下游序列：5′-TGTGACTCCAGCTTATCTCTTGG-3′。內(nèi)參β-actin上游序列：5′-TGAGCGCAAGTACTCTGTGTG-3′；內(nèi)參β-actin下游序列：5′-CAGCTCAGTAACAGTCCGC CTA-3′。

二、BV2細胞的培養(yǎng)方法

復蘇BV2細胞,用含10%的胎牛血清、1%的雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng),置于37℃,5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng),每24 h換液一次,待細胞長至80%左右按1∶10進行傳代。將細胞以2×105/孔的密度接種于6孔板中,恒溫培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24小時后顯微鏡下觀察,當細胞密度在60%～70%時進行實驗處理。

三、實驗分組

1.CCK-8法檢測細胞活力:(1)用不同濃度的TAK-242處理小膠質(zhì)細胞,24 h后計算BV2細胞的存活率。(2)用不同濃度的TAK-242預處理BV2細胞,1 h后再加入脂多糖,24 h候計算細胞存活率。

2.qRT-PCR法檢測細胞因子的mRNA表達:(1)探討不同濃度的LPS對BV2細胞的影響:將BV2細胞分為4組,分別為空白(對照)組、LPS 0.1 μg/mL組、LPS 0.5 μg/mL組、LPS 1 μg/mL組。(2)探討TAK-242預處理BV2細胞1 h后的影響:將BV2細胞分為4組,分別為空白(對照)組、TAK-242組、LPS組和TAK-242+LPS組。

四、CCK-8法檢測細胞存活率

酶聯(lián)免疫檢測儀檢測450 nm的吸光度值。細胞存活率=(加藥組OD值-不加細胞組OD值)/(空白對照組OD值-不加細胞組OD值)×100%。

五、實時熒光定量PCR法

按常規(guī)方法使用Trizol提取細胞RNA,然后使用NanoDrop 2000分光度計(美國Thermo Scientific公司)測濃度,測量后進行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,再使用羅氏96熒光定量PCR儀(美國Roche Applied Science公司)進行熒光定量檢測,獲得各組CT值。基因結(jié)果通過2-△△Ct值進行比較。

六、統(tǒng)計學分析

結(jié)　　果

一、不同濃度TAK-242對BV2細胞活力的影響

為了評估TAK-242對BV2細胞的毒性作用,用不同濃度的TAK-242處理BV2細胞24小時,CCK-8結(jié)果顯示:低濃度的TAK-242(0、0.01、0.1、1 uM)作用時未明顯影響細胞活力,但隨著TAK-242濃度的增加(2、5、10 uM),細胞的活力下降。見圖1。

圖1　CCK-8法檢測不同濃度的TAK-242對BV2細胞活力的影響

二、TAK-242對LPS誘導的BV2細胞活力的影響

BV2細胞在TAK-242(0、0.01、0.1、1、2、5、10 uM)預處理1 h,然后加入1 μg/mL的LPS培養(yǎng)24 h。與空白組相比,LPS組細胞活力明顯下降(P<0.05);與LPS組相比,低劑量TAK-242(0、0.01、0.1、1 uM)2預處理1 h后,細胞活力上升,且呈濃度依賴性(P<0.05)。因此TAK-242 1 uM用于后續(xù)實驗。見圖2。

注：a與空白對照組比較：P<0.05；b與LPS組比較：P<0.05。

圖2CCK-8法檢測TAK-242預處理BV2細胞活力的影響

三、不同濃度的LPS作用于BV2細胞后炎癥因子mRNA表達情況

不同濃度的LPS(0.1、0.5、1 μg/mL)處理的實驗組與空白對照組比較TLR4mRNA表達不同,差異具有顯著性(P<0.05),且呈濃度依賴性。見圖3。

四、TAK-242預處理后BV2細胞TLR4、MyD88、IL-1β、IL-6 mRNA表達情況

不同濃度的TAK-242預處理BV2細胞1 h后,再加入1 ug/mL的LPS培養(yǎng)24 h。與空白組比較,LPS組的TLR4、MyD88、IL-1β、IL-6 mRNA表達明顯升高,差異具有顯著性(P<0.05);與LPS組相比,TAK-242預處理1 h后,TLR4、MyD88、IL-1β、IL-6 mRNA表達下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4-7。

注：與空白對照組比較：P<0.05。

圖3熒光定量RCR法檢測不同濃度的LPS作用于BV2后TLR4mRNA表達情況

注：A為空白對照組；B為TAK-242組；C為LPS組；D為TAK-242預處理組;a與空白對照組比較：P<0.05；b與LPS組比較：P<0.05。

圖4熒光定量RCR法檢測各組細胞TLR4mRNA表達情況

注：A為空白對照組；B為TAK-242組；C為LPS組；D為TAK-242預處理組;a與空白對照組比較：P<0.05。b與LPS組比較：P<0.05。

圖5熒光定量RCR法檢測各組細胞MyD88mRNA表達情況

注：A為空白對照組；B為TAK-242組；C為LPS組；D為TAK-242預處理組;a與空白對照組比較：P<0.05；b與LPS組比較：P<0.05。

圖6熒光定量RCR法檢測各組細胞IL-1βmRNA表達情況

注：A為空白對照組；B為TAK-242組；C為LPS組；D為TAK-242預處理組;a與空白對照組比較：P<0.05；b與LPS組比較：P<0.05。

圖7熒光定量RCR法檢測各組細胞IL-6mRNA表達情況

討　　論

癲癇是一組由大腦神經(jīng)元異常放電所引起的,以短暫性中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)為特征的慢性腦部疾病,是神經(jīng)內(nèi)科的常見病多發(fā)病之一。流行病學資料顯示,癲癇的年發(fā)病率為(50-70)/10萬,年患病率為5%[8]。癲癇的反復發(fā)作,不僅嚴重的影響了患者的工作、學習和生活質(zhì)量,也為其家庭帶來了嚴重的負擔[9-10]。既往主要研究神經(jīng)元與癲癇的關(guān)系,近期越來越多的研究表明,小膠質(zhì)細胞的炎癥反應可能和癲癇的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)[11-12]。癲癇的發(fā)病過程中伴隨著免疫紊亂或異常,且TLR4/MyD88信號通路參與這一過程[13-14]。因此,我們希望通過研究TLR4/MyD88這一炎癥信號通路來研究新的治療方法,尋找新的藥物,提高患者的生活質(zhì)量、減輕家庭負擔。

TLR是免疫系統(tǒng)中的重要分子之一,其主要是通過先天性免疫反應識別病原體[15]。目前主要有11個TLR家族成員被發(fā)現(xiàn)(TLR1-TLR11),但TLR4是最早被發(fā)現(xiàn)且研究較多的受體[16]。TLR4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞等細胞中均有表達,其中小膠質(zhì)細胞表達最多[17]。TLR4通過兩條通路發(fā)揮作用,一是髓樣分化因子88(MyD88)依賴性通路,二是非依賴性通路,但是MyD88信號通路為其主要通路。MyD88是TLR4下游的一個重要接頭分子,通過LPS的刺激,MyD88募集并激活I(lǐng)L-1受體激酶-4(IRAK-4)和TNF受體相關(guān)因子-6(TARAF-6)[18],進而激活絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK),并作用于核因子κB(NF-κB)調(diào)節(jié)下游的炎癥因子轉(zhuǎn)錄,導致大量的炎癥因子(如IL-1β、IL-6等)增加,產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應[19]。本研究使用LPS作用于BV2細胞,通過qRT-PCR法檢測TLR4、MyD88、IL-1β、IL-6的mRNA表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常組上述因子表達量均較少;使用LPS刺激后因子的表達量明顯增加,與正常對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

TAK-242是一種合成的小分子物質(zhì),主要作用于TLR4受體[20],通過抑制TLR4信號通路來減輕炎癥反應。Uthra[21]在研究糖尿病視網(wǎng)膜病變時發(fā)現(xiàn),高糖導致TLR4的表達增加,使用TAK-242后能減少炎癥因子如IL-8、IL-1β、TNF-a等的表達。因此本次研究選用TAK-242作為TLR4受體抑制劑,與LPS組比較,加入TAK-242后,炎癥因子的表達量較LPS組有不同程度的下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

綜上所述,本實驗以體外培養(yǎng)的BV2小膠質(zhì)細胞為研究對象,采用LPS刺激BV2細胞構(gòu)建炎癥反應模型,用不同濃度的LPS刺激BV2細胞,能通過上調(diào)TLR4信號通路,增加炎癥因子IL-1β、IL-6的表達;TAK-242作為TLR4受體抑制劑可阻斷TLR4信號通路,能使BV2細胞存活率提高,降低炎癥因子IL-1β、IL-6的表達。因此,TAK-242對LPS誘導的炎癥反應具有保護作用,其機制通過阻斷TLR4-MyD88信號通路,使小膠質(zhì)細胞的炎癥因子表達減少,從而減輕小膠質(zhì)細胞的炎癥反應。本研究結(jié)論為TAK-242應用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應的臨床治療提供了一定的依據(jù),但仍需進一步確定臨床治療的安全性及有效性。

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