袁 艷 翁宇紅 趙淑云 李仕祥 王 珺 譚紅梅 楊敏燕 黃官友

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴陽 550004)

胚胎作為半同種移植物不被母體排斥，是傳統(tǒng)免疫理論的一個例外，而妊娠的成功與否，與母胎界面的免疫耐受狀態(tài)密切相關(guān)。母胎界面主要由來自母體的蛻膜組織及來自胚胎的滋養(yǎng)細(xì)胞組成。這種特殊的免疫理論成為生殖免疫學(xué)界一個熱點話題，因此吸引了國內(nèi)外很多學(xué)者來研究母胎界面的免疫耐受調(diào)節(jié)機(jī)制，但是至今，仍未找到確切的機(jī)制。

吲哚胺2,3-雙加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase IDO)是肝臟以外唯一可催化色氨酸分解代謝的限速酶，IDO在樹突細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞中高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，IDO主要通過降解色氨酸來產(chǎn)生免疫抑制作用[1]。IDO廣泛存在于孕早期母胎界面中，并致母胎免疫耐受[2,3]，然而在母胎界面，調(diào)節(jié)IDO表達(dá)的機(jī)制尚未闡明。

蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphat-ases，PTPs)家族是一種不含金屬酶類，是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要調(diào)節(jié)因子，主要是通過蛋白質(zhì)酪氨酸可逆磷酸化參與多種細(xì)胞功能的調(diào)控。蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶-1(Src-homology domain 2-containing protein tyrosine phosphatase-1,SHP-1)和蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶-2(Src-homology domain 2-containing protein tyrosine phosphatase-1,SHP-2)均為含有兩個SH2結(jié)構(gòu)域(Src-homology 2 domain)的酪氨酸磷酸酶，是 PTPs 家族重要成員[4]。隨著研究逐步深入，包括SHP-1、SHP-2在內(nèi)的多種PTPs超家族成員作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的正向調(diào)節(jié)因子被發(fā)現(xiàn)，其在正常細(xì)胞的生長分化以及腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附、轉(zhuǎn)移過程中起著至關(guān)重要的作用[4,5]。

本文通過分析早孕絨毛及蛻膜組織中IDO及SHP-1、SHP-2的表達(dá)及其相關(guān)性，分析SHP-1、SHP-2調(diào)節(jié)IDO表達(dá)的可能性，為探索IDO在母胎界面中免疫耐受的新機(jī)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本 選自2014年8月至2017年4月期間在貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院計劃生育手術(shù)室，孕6～9 周正常妊娠婦女行人工流產(chǎn)的絨毛及蛻膜組織。納入標(biāo)準(zhǔn)是健康婦女正常妊娠30例，妊娠6～9周，妊娠期間未用藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)是：排除全身性疾病、稽留流產(chǎn)、接受了人流前處理(如孕酮和米非司酮)治療的婦女。研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，且經(jīng)患者知情同意。

1.1.2主要試劑 蛋白酶抑制劑(P8340)和RIPA緩沖液購自Sigma公司，BCA-100蛋白定量測定制劑盒 、一抗和二抗去除液及三羥甲基氨基甲烷-甘氨酸電泳液粉劑購自碧云天公司，10×TBST購自Cell Signaling Technology 公司，ECL試劑、PVDF膜、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購自PerkinElmer公司，5×SDS-PACE 蛋白上樣緩沖液、預(yù)染蛋白相對分子質(zhì)量(Mr)Marker 購自Biosharp 公司，兔抗SHP-1抗體、兔抗SHP-2抗體、兔抗IDO抗體購自Cell Signaling Technology 公司，兔抗GAPDH抗體購自Gnne Tex公司，SDS-PACE制備試劑盒購自索萊寶公司。

1.2方法 相對無菌采集的早孕絨毛和蛻膜用PBS洗滌后，盡量去除紅細(xì)胞，取出絨毛和蛻膜組織各約100 mg，然后置于已被液氮冷卻的研缽中，加入適量液氮碾碎成粉末狀后，加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液，充分裂解后，放入4℃離心機(jī)中離心30 min，吸取上清液。用BCA測蛋白濃度，加入上樣緩沖液后煮沸使其充分變性，將樣本加入聚丙烯酰胺凝膠中電泳，電泳完成后，通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上(轉(zhuǎn)膜條件 120 V,200 mA,90 min)。用5%的脫脂奶粉封閉2 h，孵育一抗4℃過夜，洗膜后加入二抗，孵育50 min，ECL作用3分鐘后，使用一體式化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。使用Imagel J軟件處理圖片，GAPDH作為內(nèi)參對照，結(jié)果用目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶的吸光度值的比值表示。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用 SPSS19.0軟件分析。采用雙變量的直線相關(guān)性分析和配對t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。P<0.05 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1IDO在早孕絨毛及蛻膜中的表達(dá) 通過Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)，早孕絨毛和蛻膜中均有IDO蛋白的表達(dá)，IDO在蛻膜組織中表達(dá)明顯高于絨毛組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.495，P<0.01)，見圖1。

2.2SHP-1、SHP-2在早孕絨毛及蛻膜中的表達(dá) Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)，早孕絨毛和蛻膜中均有SHP-1、SHP-2蛋白的表達(dá)。SHP-1、SHP-2在蛻膜組織中表達(dá)明顯高于絨毛組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(SHP-1表達(dá)，t=5.164，P<0.001；SHP-2表達(dá)，t=9.764，P<0.0001)； SHP-1、SHP-2在蛻膜組織表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。SHP-1、SHP-2在絨毛組織中表達(dá)有明顯差異，SHP-1表達(dá)明顯高于SHP-2的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.459，P<0.001)，見圖2。

2.3IDO與SHP-1、SHP-2在早孕絨毛和蛻膜中的相關(guān)性分析 通過Western blot的結(jié)果顯示，在GAPDH表達(dá)基本一致的情況下，IDO與SHP-1、SHP-2表達(dá)呈正相關(guān)，通過直線相關(guān)分析結(jié)果顯示，在蛻膜組織IDO與SHP-1、SHP-2呈高度正相關(guān)(r=0.924，P<0.01；r=0.955,P<0.01)；在絨毛組織IDO與SHP-1、SHP-2呈高度正相關(guān)(r=0.644，P<0.01；r=0.792,P<0.01)，見圖3、4。

圖1 正常早孕蛻膜(A)和絨毛(B)組織中IDO的表達(dá)及半定量分析Fig.1 Expression and semi-quantitative analysis of IDO in chorionic decidua(A)and villi(B) tissus of early pregnancy womenNote: 1-8.Different samples of the patients；A and B.Typical experiment.*. P<0.01.

圖2 正常早孕蛻膜(A)和絨毛(B)組織中SHP-1、SHP-2的表達(dá)及半定量分析Fig.2 Expression and semi-quantitative analysis of SHP-1,SHP-2 in chorionic decidua(A)and villi(B) tissues of early pregnancy womenNote: 1-8.Different samples of the patients；A and B.Typical experiment.*.P<0.01,**.P<0.001.

圖3 蛻膜組織中IDO和SHP-1、SHP-2的表達(dá)及相關(guān)性分析Fig.3 Expression and correlation analysis of IDO with SHP-1 and SHP-2 in chorionic deciduaNote: Labels 1-7 represent different samples of the patients.A and B represent a typical experiment.

圖4 絨毛組織中IDO、SHP-1、SHP-2的表達(dá)及相關(guān)性分析Fig.4 Expression and correlation analysis of IDO with SHP-1 and SHP-2 in chorionic villiNote: Labels 1-7 represent different samples of the patients.A and B represent a typical experiment.

3 討論

吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)主要由胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞和外周血單核-巨噬細(xì)胞分泌，且有研究發(fā)現(xiàn),妊娠時IDO在胎盤中高表達(dá)[3]。最初研究 IDO 致免疫耐受(母體耐受)是在 1998 年，Munn等[6]發(fā)現(xiàn) IDO 抑制劑處理的孕鼠能迅速引起針對同種異基因孕體的排斥反應(yīng)，揭示在正常妊娠中，IDO是免疫耐受調(diào)節(jié)和維持妊娠的關(guān)鍵因素。用免疫組化方法發(fā)現(xiàn)，在早期或晚期胎盤組織的合體滋養(yǎng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中，IDO 呈中度表達(dá)，而伸入蛻膜內(nèi)，與母體免疫系統(tǒng)緊密接觸的侵入性絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞則高度表達(dá) IDO[7，8]。本研究結(jié)果表明，在早孕蛻膜及絨毛組織中均高表達(dá)IDO，IDO在蛻膜組織中的表達(dá)高于絨毛。推測在母胎界面中絨毛是發(fā)育胎兒的部分，因此在絨毛中參與免疫調(diào)節(jié)的因子較少，免疫功能也相對較弱，而蛻膜是即將發(fā)育為胎盤的部分，在以后的妊娠中是母體和胎兒的重要連接部分也是母胎界面的重要組成部分，故免疫調(diào)節(jié)功能較強(qiáng)。在母胎界面高表達(dá)的IDO可能通過下調(diào)局部 T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答來保護(hù)胎兒免受母體的免疫排斥反應(yīng)[2]。

本研究結(jié)果揭示，酪氨酸磷酸酶-1/2(SHP-1，SHP-2)在早孕蛻膜及絨毛組織中均高表達(dá)，在蛻膜組織中表達(dá)高于絨毛組織。研究發(fā)現(xiàn)IDO非催化亞單位含有兩個功能性的免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs，ITIMs)[9]。2011年，Pallotta等[10]在培養(yǎng)的DCs或漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞 (pDC)中發(fā)現(xiàn)，IDO分子上的

ITIM 磷酸化后與SHPs形成IDO/SHPs 復(fù)合物，IDO/SHPs 復(fù)合物通過抑制IL-1受體相關(guān)激酶-1(IL-1 receptor-associated kinase 1，IRAK1) 活化抗炎癥NF-κB 通路 (p52/RelB)；活化的p52/RelB 誘導(dǎo)Ⅰ型 IFN(IFNα/β)及TGF-β的表達(dá)；最終，活化的p52/RelB、IFNα/β及TGF-β均可上調(diào)IDO表達(dá)，而活化的TGF-β通過誘導(dǎo)SHPs的表達(dá)而上調(diào)IDO的表達(dá)。我們在人早孕絨毛及蛻膜組織中發(fā)現(xiàn)TGF-β可上調(diào)IDO表達(dá)(資料未發(fā)表)，并發(fā)現(xiàn)IDO與SHP-1、SHP-2呈正相關(guān)，與Pallotta等的報道一致。推測在母胎界面，SHP-1、SHP-2可能參與正性調(diào)節(jié)IDO表達(dá)。

總之，本研究分析IDO與SHP-1、SHP-2在絨毛及蛻膜組織中表達(dá)及其相關(guān)性，提示SHP-1和SHP-2可能通過調(diào)節(jié)IDO的表達(dá)，參與IDO在母胎界面的免疫調(diào)節(jié)。

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