孫建莉，陳勇華，林賽爭，劉曉，洪瓊懌，李文麗，曹群奮

胃癌的發(fā)生與幽門螺旋桿菌（Hp）感染關(guān)系密切，Hp正常條件下呈螺旋形，但在對其生長不利的環(huán)境中Hp易發(fā)生細胞壁缺失而形成球形幽門螺桿菌（Hp-L型）。越來越多的實驗研究表明胃癌組織中Hp主要以L型存在，Hp-L型感染后導(dǎo)致胃黏膜氧自由基和細胞因子等的釋放，進而引起細胞DNA損傷及影響癌基因和抑癌基因表達的失調(diào)，導(dǎo)致胃上皮細胞增殖與凋亡失衡。Hp-L型感染與胃癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究成為近年來國內(nèi)學者探究的熱點。

腫瘤易感基因101（TSG101）及人類Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（RUNX3）分別為腫瘤易感基因及抑癌基因，二者是胃癌發(fā)生發(fā)展中重要的調(diào)控基因，其可通過多種途徑調(diào)控細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其他生物學效應(yīng)，進而影響細胞的生長發(fā)育與凋亡。本文旨在研究Hp-L型感染是否可通過調(diào)節(jié)TSG101及RUNX3的表達來參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗樣本 收集杭州市迪安診斷中心2015年1月至2016年12月存檔的石蠟包埋胃癌組織89份（來自89例患者）為實驗組，隨機抽取35份對應(yīng)癌旁組織為對照組。所有組織切片均經(jīng)兩名專業(yè)病理醫(yī)師確認，所有患者的臨床資料完整。所有患者術(shù)前未行根除Hp、放化療及其他治療史。其中男58例，女31例；年齡41～81歲，平均年齡61歲；高、中分化38例，低分化51例；胃癌TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期29例，Ⅲ～Ⅳ期60例。

1.2 實驗試劑 鼠抗人RUNX3單克隆抗體、兔抗人TSG101抗體購自Abcam公司；兔抗人Hp-L型抗體、二抗、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；蘇木素：Sigma公司。

1.3 實驗方法 所有組織切片予烤片后采用SP法進行免疫組化染色。二甲苯脫蠟，梯度酒精復(fù)水，阻斷、滅活內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復(fù)、滴加一抗及二抗（各一抗稀釋濃度為均為1∶100，PBS代替一抗作為陰性對照），DAB反應(yīng)染色，蘇木素復(fù)染，干燥，封片，拍照。

1.4 判斷標準 RUNX3的陽性部位在細胞質(zhì)或細胞核中（封二彩圖7），TSG101陽性部位在細胞質(zhì)內(nèi)，以出現(xiàn)著色清晰的棕黃色顆粒為陽性標準（封二彩圖8）。RUNX3及TSG101的評分標準：顯微鏡下觀察，每張免疫組化切片隨機選擇 5個不同的視野（×200）觀察，并判讀陽性表達強度和陽性率。染色結(jié)果采用半定量分析方法：以染色強度結(jié)合陽性細胞數(shù)百分比進行評分。染色強度以多數(shù)細胞呈現(xiàn)的染色強度并減去背景著色計分：無明顯著色為0分，輕微為1分，中度為2分，重度為3分。陽性細胞百分比即每張免疫組化切片選擇 3個不同的視野（×200）進行觀察：0～5%評為0分，6%～25%評1分，26%～50%評2分，51%～75%評3分，＞75%均評為4分。對每個視野均進行染色強度計分與陽性細胞百分比評分，最終評分為陽性細胞百分比與染色強度之和，其中≥4分評為陽性，＜4分評陰性。

Hp-L陽性標準為細胞膜或胞質(zhì)內(nèi)著棕色細顆粒（（封二彩圖9）。指標以陽性視野的數(shù)目判讀陽性強度，無陽性視野記為陰性（－），1個或2個陽性視野記為弱陽性（+），3個或4個陽性視野記為中度陽性（2+），5個陽性視野記為強陽性（3+）。

1.5 統(tǒng)計方法采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料比較采用檢驗。＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義

2 結(jié)果

2.1 TSG101在胃癌組織中的表達及其與臨床病理因素的關(guān)系 胃癌組中TSG101蛋白表達陽性率為62.9%（56/89），對照組中陽性表達率為 37.1%（13/35），胃癌組織中TSG101蛋白表達顯著高于癌旁組織（2=6.764，P ＜ 0.05）。在胃癌組中，TSG101蛋白的表達與腫瘤的分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)（均P＜0.05），而與性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期均無關(guān)（均P＞0.05）。見表1。

2.2 RUNX3在胃癌組織中的表達及其與臨床病理因素的關(guān)系 胃癌組中RUNX3蛋白表達陽性率為30.3%（27/89），對照組中陽性表達率為 82.9%（29/35），胃癌組織中RUNX3蛋白表達顯著低于癌旁組織（2=27.980，P ＜ 0.05）。RUNX3蛋白在胃癌組織中的表達與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均有關(guān)（均P＜0.05），而與性別、年齡、腫瘤大小、分化程度均無關(guān)（均P＞0.05）。見表1。

2.3 Hp-L型在胃癌組織及癌旁組織中的感染情況Hp-L型在胃癌組中的陽性率為71.9%（64/89），對照組中的陽性率則為28.6%（10/35）。胃癌組織中Hp-L型感染率顯著高于癌旁組織（2=19.608，P ＜0.05）。

2.4 胃癌組織中Hp-L型感染與TSG101、RUNX3蛋白表達的關(guān)系 Hp-L型陽性及陰性的胃癌組織中，TSG101蛋白表達陽性率分別為70.3%（45/64）、44.0%（11/25），兩者差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）。RUNX3蛋白表達陽性率則分別為18.8%（12/64）和60.0%（15/25），兩組差異有統(tǒng)計學意義（2=14.475，P＜0.05）。見表2。

3 討論

Hp作為胃癌的獨立危險因素已被全球公認，根除Hp可有效降低胃癌的發(fā)生率。但在根除Hp治療的過程中，不規(guī)范使用抗生素等易致Hp出現(xiàn)L型變異[1]，一定條件下Hp-L型還可回復(fù)成原菌形態(tài)，使病變進展或復(fù)發(fā)，不斷造成胃組織損傷，引起持續(xù)的炎癥，增加癌變機會，故L型與原菌相比具有更大的黏附性、侵襲性和危險性。本文證實胃癌組織中Hp-L型感染率顯著高于癌旁組織。研究發(fā)現(xiàn)Hp-L可與巨噬細胞移動抑制因子（MIF）共同促進血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的表達，從而促進胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移DNA修復(fù)基因著色性干皮病基因F（XPF）在核苷酸切除修復(fù)途徑中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，XPF的高表達提示腫瘤預(yù)后不良；而Hp-L可上調(diào)胃癌中XPF的表達[2-3]。

表1 胃癌組織中TSG101及RUNX3蛋白的表達與胃癌臨床病理因素的關(guān)系 例

TSG101在多數(shù)惡性腫瘤組織或細胞系中呈現(xiàn)高表達。本實驗發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比，胃癌組織中TSG101蛋白表達顯著上調(diào)，且其表達與腫瘤的分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，該結(jié)果與文獻[4-5]的實驗結(jié)論一致，這說明TSG101在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，該過程可能是TSG101通過下調(diào)E-鈣黏蛋白(E-cadherin)介導(dǎo)的，E-cadherin是一種重要的介導(dǎo)細胞互相黏附的跨膜糖蛋白分子。張敏等[6]研究證實高表達TSG101的SGC-7901胃癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力較未轉(zhuǎn)染組明顯增強。此外TSG101可通過上調(diào)VEGF的表達促進胃癌血管形成[7]，而血管的大量形成則可促進胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。本研究還發(fā)現(xiàn)胃癌組織Hp-L陽性組較其陰性組TSG101蛋白表達顯著增加，提示Hp-L還可通過上調(diào)胃癌組織中TSG101的表達來影響胃癌的發(fā)生發(fā)展，具體機制尚不明確，需待進一步研究。

RUNX3可調(diào)節(jié)多個基因的表達來參與細胞的生長、發(fā)育、凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及生物學效應(yīng)，從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演了很重要的角色。一項最新的Meta分析顯示RUNX3基因啟動子區(qū)DNA的甲基化正是該基因低表達或缺失的主要原因，甲基化修飾作用主要發(fā)生在DNA的CpG島[8]。此外RUNX3也可通過雜合性缺失而失活，進而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9]。本實驗證實 RUNX3的下調(diào)或缺失在胃癌的發(fā)生與進展中發(fā)揮了重要的作用，RUNX3在胃癌中的低表達或缺失與Hp-L型感染有一定關(guān)系，其機理可能與細胞毒素相關(guān)基因蛋白（CagA）促使RUNX3啟動子區(qū)DNA的甲基化有關(guān)[10]。

表2 Hp-L型陽性及陰性的胃癌組織中TSG101及RUNX3的表達 例

參考文獻：

[1] 吳曉娟,陳崢宏,王菲,等.阿莫西林誘導(dǎo)L型形成對幽門螺桿菌感染治療效果的影響[J].中國抗生素雜志,2013,38(9)：720,S1-S3.

[2] 歐玉榮,康敏,周蕾,等.胃癌中幽門螺桿菌L型感染與MIF、MMP9、VEGF表達的關(guān)系[J].南方醫(yī)科大學學報,2014,34(2)：180-187.

[3] 王名法,劉友斌.XPF、P53蛋白在胃癌組織中的表達及與幽門螺桿菌L型感染的關(guān)系[J].臨床與實驗病理學雜志,2015,31(10)：1089-1094.

[4] 靳雁.TSG101在胃癌中的表達及意義[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學,2009,17(9)：1725-1726.

[5] 艾小順,劉友富,董偉,等.TSG101與Ecadherin在胃癌組織表達的相關(guān)性及預(yù)研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學,2012,20(12)：2591-2594.

[6] 張敏,王琦,任曉靜,等.腫瘤易感基因101表達對胃癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響[J].中華醫(yī)學雜志,2013,93(16)：1219-1223.

[7] 楊揚,張敏,任曉靜,等.腫瘤易感基因101對胃癌細胞血管形成的影響[J].中華實驗外科雜志,2014,31(11)：2420-2422.

[8] Liu X,Wang L,Guo Y,The association be tween runt-related transcription factor 3 gene promoter methylation and gastric cancer：A meta-analysis[J].JCancer Res Ther,2016,12(Supplement)：50-53.

[9]Mori T,Nomoto S,Koshikawa K,et al.Decreased ex-pression and frequent allelic inactivation of the RUNX3 geneat 1p36 in human hepatocellular carcinoma[J].Liver Int,2005,25(2)：380-388.

[10]Choi J,Kim SG,Kim BG,et al.Helicobacter pylori eradication modulatesaberrant CpGisland hypermethylation in gastric carcinogenesis[J].Korean JGastroenterol,2016,68(5)：253-259.