曹炳，沈志森，林樂希，郝文娟，周重昌

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，90%以上喉癌的病理類型是鱗狀細胞癌。盡管近幾十年來，喉癌的預防、診斷和治療取得了很大進步，但5年生存率仍然很差[1]。手術輔助放化療是目前最常見的治療方法，然而治療后患者易出現(xiàn)言語障礙和呼吸困難，降低了患者生活質量[2]。喉癌的發(fā)病機制復雜，涉及遺傳、表觀遺傳和環(huán)境因素。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾。大量研究證實，DNA異常甲基化引起表達抑制或沉默，從而促進了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[3]。

人類YPEL3定位于16p11.2，是一個p53信號通路中受p53調控的腫瘤抑制因子，其編碼的蛋白質能夠誘導人類腫瘤細胞的老化而引起其生長停滯[4]。有研究表明，YPEL3表達下調可以增加腫瘤細胞遷移和侵襲性，從而促進了癌癥的發(fā)生和進展[5]。另外，YPEL3的表達在卵巢癌中由于啟動子高甲基化而下調[6]。然而，YPEL3啟動子甲基化與喉癌相關性的研究尚無報道。因此，筆者研究YPEL3基因在喉癌中的甲基化狀態(tài)，并分析YPEL3啟動子甲基化水平與臨床病理特征的相關性。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年1月至2016年1月寧波大學附屬李惠利醫(yī)院收治的喉癌患者的癌組織及對應的癌旁正常組織91例，并收集患者基本臨床病理資料，所有患者均排除術前放化療史和癌癥史。其中男87例，女4例；年齡40～86歲；73例既往有吸煙史。分期參照國際抗癌協(xié)會（UICC）TNM分類標準（2002）：I/II期44例，III/IV期47例。此外，高中分化鱗癌78例，低分化鱗癌13例；有淋巴結轉移的32例，無淋巴結轉移的59例。組織切除后立即投入液氮，然后轉存－80℃冰箱冷凍保存。所有參與者簽署了知情同意書，并獲得本院倫理委員會的批準。

1.2 DNA提取和亞硫酸氫鹽修飾 根據(jù)制造商的說明書，使用 QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen，Hilden，Germany）從 91對組織標本中提取基因組DNA。使用NanoDrop 1000分光光度計（Thermo Fisher Scientific Co.Ltd.，Wilmington，USA）評估DNA質量和數(shù)量。嚴格按照制造商的說明書（Zymo Research，Orange，CA，USA），使用具有ZYMOEZDNA Methylation-Gold Kit的Methylamp DNA修飾試劑盒進行亞硫酸氫鹽修飾。

1.3 實時熒光定量甲基化特異性聚合酶鏈反應（qMSP） 采用qMSP檢測YPEL3基因啟動子甲基化狀態(tài)。操作步驟按照LightCycler 480（德國Roche Diagnostics公司）進行擴增。qMSP所需引物：YPEL3-正 義 5’-TTAGGTGATTTTTAATTTTTACGGC-3’，YPEL3- 反 義 5’-CTAAACTATCAATTCCCAATTTCGA-3’。內(nèi)參為 -actin基因（ACTB），ACTB-正義5’-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3’，ACTB-反義5’-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3’。PCR反應的體系為20l，包括 ddH2O 6l，模板 DNA 2l，PCR Buffer 10l，上下游引物各1l。PCR反應條件為：95 ℃預變性 10 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72℃30 s，共50個循環(huán)。采用亞硫酸氫鹽轉化通用甲基化人類DNA標準（ZYMO研究公司）作為陽性對照。ACTB被用作內(nèi)部控制。qMSP可以通過甲基化指數(shù)（PMR）進行指標量化。PMR代表基因甲基化陽性的模板DNA在其中所占的比例。PMR=2－ Ct×100%，其中 Ct=（Ct樣本－Ct內(nèi)參）－（Ct陽參－Ct內(nèi)參）。

1.4 統(tǒng)計方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示。＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 喉鱗狀細胞癌患者YPEL3甲基化與臨床病理參數(shù)的關系

2 結果

2.1 YPEL3基因啟動子甲基化在喉癌組織和癌旁正常組織中的狀態(tài) 喉癌組織中 YPEL3啟動子甲基化水平明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見封二彩圖10。

2.2 YPEL3基因啟動子甲基化與臨床病理特征的相關性 男性患者 YPEL3基因啟動子甲基化水平明顯高于女性患者（P＜0.05），有吸煙史的患者YPEL3啟動子甲基化水平明顯高于無吸煙史患者（P＜0.05），與高中分化癌組織學類型的患者相比，低分化的患者的YPEL3甲基化水平增加（P＜0.05）。然而，YPEL3甲基化與年齡、臨床分期、T分期及淋巴結轉移無關（P＞0.05）。見表1。

2.3 YPEL3基因在喉癌中的診斷價值 ROC曲線下面積（AUC）高達 0.697（95%CI=0.620 ～ 0.774，P＜0.01）。取最大約登指數(shù)作為截點，甲基化率的臨界值為0.0872，此時預測喉癌的敏感度和特異度分別為50.50%和86.80%。見封二彩圖11。

3 討論

喉癌的發(fā)生、發(fā)展與相關抑癌基因的失活相關，而這些抑癌基因失活的機制中，喉癌相關基因的異常甲基化是其中極為重要的機制之一，包括CBY、IGFBP-rP1和 MYCT1。

YPEL基因家族包括5個成員，即 YPEL1～YPEL5。YPEL家族蛋白的功能與細胞分裂相關聯(lián)。YPEL3是依賴p53蛋白調控的基因，其編碼蛋白通過引起程序性細胞死亡而誘導細胞的增殖抑制。

YPEL3基因啟動子異常甲基化在腫瘤中發(fā)揮重要作用。Kelley等[5]發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，卵巢癌組織中YPEL3啟動子甲基化率增高，而YPEL3表達下調，從而抑制細胞凋亡，促進癌細胞生長和增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比，喉癌組織的YPEL3啟動子甲基化率明顯增高，提示YPEL3甲基化是喉癌常見的特異性事件，并且有可能作為喉癌早期診斷的生物標記物。

喉鱗狀細胞癌的組織學類型對其治療和預后具有重要的意義[6]。本研究表明YPEL3可能在喉癌的進展中發(fā)揮關鍵作用，可作為LSCC分化程度判定的潛在分子生物學標記物。吸煙是導致喉癌和肺癌的重要環(huán)境誘導因素。吸煙會引起基因DNA甲基化異常，促進腫瘤的發(fā)生和進展[7]。肺癌相關基因甲基化研究表明，有長期吸煙史的肺癌患者的基因啟動子甲基化率明顯高于無吸煙史的肺癌患者[8]。本研究發(fā)現(xiàn)吸煙者的YPEL3啟動子甲基化水明顯高于無吸煙者。說明吸煙可能通過提高YPEL3甲基化水平，從而促進喉癌的發(fā)生和進展。

喉癌相關腫瘤標記物包括癌胚抗原（CEA）、組織多肽抗原（TPA-M）、鱗狀細胞癌抗原（SCCA）和細胞角蛋白19片段（CYFRA 21-1）。而CEA、TPA-M、SCCA和 CYFRA 21-1在喉癌診斷中的敏感度為16.5%～46.8%[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，YPEL3在喉癌篩查中具有較高的敏感度和特異度，表明YPEL3甲基化在喉癌早期診斷中具有更高的診斷價值。

參考文獻：

[1] Siegel RL,Miller KD,Jemal A,et al.Cancer Statistics[J].CA Cancer JClin,2017,67(1)：7-30.

[2] Luo J,Wu J,Lv K,et al.Analysis of postsurgical health-related quality of lifeand quality of voiceof patientswith laryngeal carcinoma[J].Medicine(Baltimore),2016,95(1)：e2363.

[3]Delpu Y,Cordelier P,Cho WC,et al.DNA methylation and cancer diagnosis[J].Int JMol Sci,2013,14(7)：15029-15058.

[4]Berberich SJ.RNAiknockdown of HdmX or Hdm2 leads to new insightsintop53signaling[J].Cell Cycle,2010,9(18)：3640-3641.

[5]Kelley KD,Miller KR,Todd A,et al.YPEL3,ap53-regulated genethatinducescellular senescence[J].Cancer Res,2010,70(9)：3566-3575.

[6] Ferlito A,Thompson LD,Cardesa A,etal.Theimportanceof histological typesfor treatment and prognosisin laryngeal cancer[J].Eur Arch Otorhinolaryngol,2013,270(2)：401-403.

[7]Zeilinger S,Kühnel B,Klopp N,etal.Tobaccosmokingleadstoextensivegenomewide changes in DNA methylation[J].PLoSOne,2013,8(5)：e63812.

[8]Liu Y,Lan Q,Siegfried JM,etal.Aberrantpromoter methylationof p16 and MGMT genes in lung tumors from smoking and neversmoking lung cancer patients[J].Neoplasia,2006,8(1)：46-51.

[9]Eleftheriadou A,Chalastras T,Ferekidou E.Clinical effectiveness of tumor markersinsquamouscell carcinomaof thelarynx[J].Anti cancer Res,2006,26(3B)：2493-2497.