耿飛飛 于洪賢 劉曼紅 孟瑤

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

搖蚊幼蟲為完全變態(tài)類昆蟲，是一種分布廣泛且種類數量眾多的底棲動物，具有解毒能力低、對污染物的暴露敏感、生活周期短等特性，且在實驗室內易飼養(yǎng)，是水體質量監(jiān)測中的重要指示生物。在加強水生態(tài)毒理學應用研究中，搖蚊幼蟲被廣泛應用于毒性測試[1-2]。依據搖蚊幼蟲對水體中重金屬的敏感性，開展了重金屬對搖蚊幼蟲的急性和慢性毒性實驗[3]。相關研究有，Cu2+、Cd2+對紅裸須搖蚊(Propsilocerusakamusi)幼蟲和羽搖蚊(Chironomusplumosus)幼蟲的急性毒性效應及對過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTs)活性的影響[4-5]等。Hg2+是存在于水環(huán)境中極具毒性的重金屬，其毒性涉及到氧化應激，即Hg2+可誘導自由基的形成，并改變了細胞的抗氧化能力[6-8]，暴露于含有Cd和Cu的沉積物，對伸展搖蚊(Chironomustentans)幼蟲具有致畸作用[9]。

關于生物體內重要解毒酶，我國近年來也開展了一些工作，研究的污染物涉及重金屬、有機物污染物和工業(yè)廢水?；谶@些特性，搖蚊幼蟲作為水生態(tài)系統(tǒng)食物鏈的關鍵環(huán)節(jié)，其體內抗氧化酶的活性或表達量與重金屬Hg濃度之間的效應關系，可作為監(jiān)測環(huán)境污染的一項靈敏指標?？寡趸赶当挥米髦甘经h(huán)境污染的早期預警，從而成為分子毒理學生物標志物研究的熱點之一[10-12]。然而，搖蚊幼蟲在Hg2+的脅迫下，生物體內重要的抗氧化酶，如CAT、過氧化物酶(POD)、SOD、谷丙轉氨酶(GST)的活性如何，還需要進行科學驗證。

紅裸須搖蚊是搖蚊中的優(yōu)勢種，廣泛分布于我國的淡水環(huán)境中，在水生態(tài)系統(tǒng)食物鏈中占有重要的地位。本研究以紅裸須搖蚊幼蟲為實驗材料，研究4種生物指標(CAT、POD、SOD、GST)在汞暴露下的變化規(guī)律，目的是探究汞對紅裸須搖蚊幼蟲抗氧化系統(tǒng)的效應，同時用以評估紅裸須搖蚊幼蟲對汞脅迫的敏感性，為將紅裸須搖蚊幼蟲重金屬污染的生物監(jiān)測提供參考。

1 材料與方法

實驗用紅裸須搖蚊購于哈爾濱市哈平路花鳥魚蟲市場，在實驗室蒸餾水環(huán)境下，饑餓處理24h，挑選活性好、大小一致的4齡幼蟲用于試驗。試驗用水為蒸餾水，每日投喂顆粒金魚料作為搖蚊幼蟲食物，水溫(21.0±0.5)℃、pH為7.0±0.5，室內自然光下進行。試驗用的Hg2+用分析純HgCl2(質量分數為99.5%，姜堰市環(huán)球試劑廠)配置；用蒸餾水將HgCl2配成一定質量濃度的母液，再以蒸餾水稀釋成所需質量濃度的實驗溶液。蛋白質、CAT、POD、SOD的測定，利用相應的試劑盒(南京建成生物工程研究所)完成。采用SPSS17.0軟件計算半數效應質量濃度(ch)及95%置信區(qū)間。

利用凈水染毒法試驗。通過預試驗，根據寇氏改良法得到紅裸須搖蚊幼蟲的48 h半致死質量濃度(cs)為3.61 mg/L。將HgCl2用蒸餾水設置成質量濃度為0(對照組)、1.6、2.4、3.6、5.4、8.1 mg/L的處理組，每組設置3個平行樣。將用于試驗的紅裸須搖蚊幼蟲放入500 mL帶有Hg2+的燒杯中，每個燒杯放50個，6、24、48、72 h取活性較好的搖蚊幼蟲置于冰箱中-20 ℃保存，用作蛋白質、CAT、POD、SOD的測定。

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對試驗數據進行分析。在同一時間段、不同質量濃度Hg2+對酶活性的影響，用SPSS軟件的單因素方差分析進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 Hg2+對紅裸須搖蚊幼蟲CAT活性的影響

用不同質量濃度的HgCl2(0、1.6、2.4、3.6、5.4、8.1 mg/L)，分別處理紅裸須搖蚊4齡幼蟲6、24、48、72 h。6 h其體內CAT活性，在不同處理組表現為：隨著汞質量濃度的增大，對酶的活性影響是先增加后減少的變化趨勢，在5.4 mg/L時被顯著誘導，達到最大值(0.233±0.002)U/mg；在8.1 mg/L時開始下降，為(0.039±0.025)U/mg。除了質量濃度8.1 mg/L，其它的質量濃度隨著毒物作用時間的延長，在24 h被顯著誘導，表現出最大的酶活性，然后在48 h以后酶的活性被抑制，即出現不同程度的下降。處理組8.1 mg/L在作用時間48 h，CAT活性最大，為(0.271±0.016)U/mg，在Hg2+作用72 h每個處理組的CAT活性被抑制，都呈現下降趨勢(見表1)。同一時間不同質量濃度的Hg2+處理，對CAT活性影響的LSD法多重比較檢驗結果顯示，48 h與72 h的各質量濃度Hg2+對CAT活性都沒有明顯差異，僅在24 h時SOD活性在對照組與其他質量濃度處理組之間的差異達到了顯著性水平(p<0.05)(見表1)。

表1 Hg2+處理后紅裸須搖蚊幼蟲的CAT活性

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.2 Hg2+對紅裸須搖蚊幼蟲POD活性的影響

在Hg2+脅迫下，不同處理組的紅裸須搖蚊幼蟲體內POD的活性，在24 h時被誘導，在(0.615±0.020)～(0.683±0.028)U/mg之間，隨著處理時間的延長有增加的趨勢。同一時間不同處理組，對POD活性影響的LSD法多重比較檢驗結果顯示，各時間段，各質量濃度Hg2+的POD活性與對照組相比變化不顯著(p>0.05)。說明POD在受到Hg2+脅迫時，不同處理時間和不同處理組的紅裸須搖蚊幼蟲體內POD活性，沒有明顯的劑量-效應關系，表現相對復雜的變化(見表2)。

表2 Hg2+處理后紅裸須搖蚊幼蟲的POD活性

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.3 Hg2+對紅裸須搖蚊幼蟲體內SOD活性的影響

由表3可見：Hg2+脅迫下，不同的處理組紅裸須搖蚊幼蟲體內SOD酶的活性，高質量濃度的處理組(5.4、8.1 mg/L)，在長的暴露時間(48、72 h)，SOD的活性都較高，在72 h都達到最大值，并且5.4 mg/L處理組最大，為(0.922±0.055)U/mg。不同處理組，如1.6、2.4、3.6 mg/L處理組，在48 h的SOD酶活力較低些，為(0.333±0.062)～(0.814±0.065)U/mg；5.4 mg/L處理組，隨著作用時間的延長，在24 h時SOD酶活力降低，為(0.420±0.086)U/mg；8.1 mg/L處理組，在暴露6、24 h，紅裸須搖蚊幼蟲體內SOD酶活力均稍低于對照組。同一時間不同質量濃度的Hg2+處理，對SOD活性影響的LSD法多重比較檢驗結果顯示，24、48 h的各質量濃度Hg2+對SOD活性都沒有明顯差異，僅在72 h時SOD活性在對照組與其他質量濃度處理組之間的差異達到了顯著性水平(p<0.05)(見表3)。

表3 Hg2+處理后紅裸須搖蚊幼蟲的SOD活性

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.4 Hg2+對紅裸須搖蚊幼蟲體內GST活性的影響

由表4可見：Hg2+脅迫下，不同的處理組紅裸須搖蚊幼蟲體內GST酶的活性，在暴露24 h，1.6、2.4、3.6、5.4 mg/L各處理組，GST的活性都表現為較高，并且短的暴露時間24 h達到最大值為(0.767±0.082)U/mg。而在高質量濃度(8.1 mg/L)處理組，暴露6 h表現最高，為(0.808±0.060)U/mg。隨著作用時間的延長，在24、48、72 h時，GST酶活力逐漸降低，而暴露6 h各處理組酶活性差異顯著。同一時間不同質量濃度的Hg2+處理，對GST活性影響的LSD法多重比較檢驗結果顯示，暴露48、72 h的各質量濃度Hg2+對GST活性都沒有明顯差異(p>0.05)；在6、24 h時，GST活性在對照組與其他質量濃度處理組之間的差異達到了顯著性水平(p<0.05)。說明在受到Hg2+脅迫時，不同處理組的紅裸須搖蚊幼蟲體內GST活性發(fā)生明顯的劑量-效應關系。

表4 Hg2+處理后紅裸須搖蚊幼蟲的GST活性

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

3 討論

關于汞對水生動物的急性毒性研究已有一些報道。在對魚類和甲殼類動物的研究中，孔祥會等[13]將金魚幼魚置于質量濃度為0、0.2、1.0、5.0、10.0 μg/L的Hg2+溶液中，分別在汞暴露1、7、15 d時取樣，測定不同質量濃度Hg2+暴露下SOD、CAT活性及丙二醛(MDA)含量。結果顯示，SOD、CAT均表現出在較長的暴露時間及較高質量濃度Hg2+脅迫下的誘導效應，MDA含量也因Hg2+暴露而明顯積累。

CAT、POD、SOD、GST等會受到外界刺激的影響，因而對生物機體抗氧化狀態(tài)的測定、對于理解毒性效應機制及預測生物體內的潛在性損傷是十分重要的[7]。重金屬對搖蚊幼蟲的抗氧化酶的研究中發(fā)現，不同的搖蚊幼蟲對污染物的耐受性存在一定的差異，Cd2+對紅裸須搖蚊幼蟲與其它搖蚊幼蟲明顯不同，該物種對Cd2+的急性毒性不敏感，表現出非常強的耐受能力[1]。本研究結果顯示，CAT和SOD均表現出較長的暴露時間及較高質量濃度Hg2+脅迫下的誘導效應，紅裸須搖蚊幼蟲為了減弱汞脅迫帶來的損害，CAT和SOD均有增加然后減少的拋物線形式的變化。CAT等抗氧化防御系統(tǒng)的一個重要特征，是其活性成分或含量可由于污染物的脅迫而發(fā)生改變，從而可間接反映環(huán)境中氧化污染的存在，因此可作為環(huán)境污染脅迫的指標。本研究發(fā)現，紅裸須搖蚊幼蟲體組織抗氧化防御系統(tǒng)中，主要抗氧化酶CAT和SOD活性對Hg2+具有較高的敏感性，而隨著重金屬離子暴露質量濃度的升高，其含量和活性均呈現明顯的劑量-效應關系，可以作為生物標志物檢測水體中Hg2+的早期污染。而且GST活性對Hg2+有誘導效應，具有極高的檢測靈敏度，但是，由于檢測必須在純凈的溶液中進行，因此作為實際檢測物質還具有一定難度[14]。在Hg2+暴露下的紅裸須搖蚊幼蟲體組織，POD活性表現的規(guī)律性不明顯，呈相對復雜的變化，因此認為POD不能有效用來檢測水體的早期Hg2+污染。Park et al.[15]研究發(fā)現，經毒物暴露后，搖蚊幼蟲體內GSTs的活性發(fā)生了顯著的變化。為進一步完善Hg2+對紅裸須搖蚊的抗氧化酶系統(tǒng)的研究，如乙酰膽堿酯酶(AChE)、GSTs等酶活性如何，還需要進一步驗證。

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