包婷雯 左明麗,3 丁 玉 林鵬程,3*

(1.青海民族大學(xué)藥學(xué)院，青海 西寧 810007；2.青海省青藏高原植物資源化學(xué)研究重點實驗室，青海 西寧 810007；3.青海省藥物分析重點實驗室，青海 西寧 810007)

世界衛(wèi)生組織預(yù)測，未來20年全世界每年新發(fā)癌癥病例將達到2200萬，同期癌癥死亡人數(shù)上漲到1300萬例[1]。其中，中國占全世界新發(fā)癌癥病例的20%[2]。所有癌癥的共同特征是癌癥發(fā)生時細胞周期混亂, 調(diào)控細胞周期的因子消失、過表達或者突變。癌癥最重要的特征是細胞的惡性增殖, 而細胞增殖又需要細胞分裂周期基因(CDC)的參與[3]。若能夠?qū)ふ业骄哂刑禺愋缘囊种茞盒约毎芷诨虻囊种苿?,那么癌細胞將無法進行增殖, 從而達到控制甚至治療癌癥的目的。細胞周期中必需的CDC25基因所表達的蛋白, CDC25磷酸酶是細胞周期調(diào)控蛋白 ,在正常的細胞周期中具有重要的作用。

哺乳動物中CDC25磷酸酶有3個型，分別是CDC25A、CDC25B、及CDC25C。

本試驗將通過CDC25A/CDC25B建立的高通量篩選模型進行體外酶抑制活性測定，篩選獲得活性藏藥材乙醇提取物[4]。在對CDC25磷酸酶的研究過程中 ,發(fā)現(xiàn)細胞CDC25A表達水平的失控會導(dǎo)致細胞周期的紊亂，降低 DNA 的穩(wěn)定性，進而促進惡性腫瘤細胞的增殖[5]。已在肝癌、胰腺癌、胃癌等腫瘤中發(fā)現(xiàn)有 CDC25A 的高表達，并伴隨不良預(yù)后[6]。CDC25B屬短半衰期蛋白，與紡錘體形成有關(guān)，在DNA損傷后，作用于細胞恢復(fù)周期關(guān)鍵時期[7]。CDC25B的過量表達促進腫瘤生長和細胞的惡性轉(zhuǎn)化。CDC25B在人類肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌中有較高表達[8-9]。因此，CDC25A/CDC25B成為公認的惡性腫瘤研究和治療的靶點之一[10]，本實驗利用基于重組表達的周期調(diào)節(jié)物可能對于癌癥治療是一個潛在的靶物質(zhì)。因此，CDC25磷酸酶抑制劑的研制對于開發(fā)新的抗癌藥物具有極其重要的意義。

1 材料

單道可調(diào)型移液器(德國Brand)，多道可調(diào)型移液器(德國Brand)，POLARstar Omega全自動多功能酶標(biāo)儀(德國BMG Labtech公司)，384孔酶標(biāo)板(美國Corning)；蛋磷酸激酶CDC25A (人)活性熒光檢測試劑盒KA0083(臺灣Abnova)；蛋磷酸激酶CDC25B (人)活性熒光檢測試劑盒KA0083(臺灣Abnova)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑，試驗用水為超純水(自制)。采于青海境內(nèi)48種藏藥材乙醇提取物，將全草用質(zhì)量百分濃度65%～95%乙醇超聲提取1h，然后過濾并回流提取，合并提取所獲得浸膏，取0.4mg，溶解于100μL的DMSO中，超聲5min。再分別取1μL溶解樣品的DMSO，分別加入緩沖溶液99μL，得用于檢測抗CDC25磷酸酶待測物。

2 方法

2.1 反應(yīng)原理 利用基于重組表達的CDC25A/CDC25B建立的高通量篩選模型進行體外酶抑制活性測定，篩選獲得活性乙醇提取物。

將反應(yīng)體系于37℃條件下孵育20 min，之后加入CDC25A/CDC25B，同樣條件下繼續(xù)反應(yīng)60 min，待反應(yīng)完全，檢測在485 nm激發(fā)光作用下反應(yīng)產(chǎn)物于520 nm處的熒光強度。酶活性存活率采用下列公式計算：酶活性存活率 = 實驗組測定值 / 對照組1測定值。其中酶活性存活率越低，說明測試樣品對組蛋白磷酸化酶CDC25A/CDC25B的抑制效果越強。

2.2 反應(yīng)體系 抑制組蛋白磷酸激酶CDC25A/CDC25B活性測試實驗，設(shè)置三組反應(yīng)，分別是實驗組、對照組1(加酶不加抑制分子)、對照組2(不加酶加抑制分子)。

實驗組反應(yīng)在18 μL體系進行：2.7 μL 330 μmol/L FDP，1.8 μL 100 μmol/L測試物，2 μL 0.1 μmol/L CDC25A/CDC25B，11.5 μL FDP buffer。

對照組1反應(yīng)在18 μL體系進行：

2.7 μL 330 μmol/L FDP，2 μL 0.1 μmol/L CDC25A/CDC25B，13.3 μL FDP buffer

對照組2反應(yīng)在18 μL體系進行：2.7 μL 330 μmol/L FDP，1.8 μL 100 μmol/L測試物，13.5 μL FDP buffer。

3 結(jié)果

結(jié)果表明，11種藏藥材(防風(fēng)、荊芥、雪層杜鵑、鎖陽、側(cè)金盞、斑花黃堇、黑頂黃堇、條裂黃堇、尼泊爾黃堇、粗梗黃堇及柳蘭)對CDC25A/CDC25B有明顯的抑制效果，均低于50%的抑制率；小葉紅景天和藍玉簪龍膽只對CDC25A有明顯的抑制效果，均低于50%的抑制率；甘青烏頭、四數(shù)獐牙菜、鐵線蓮、小花刺參及雪蓮只對CDC25B有明顯的抑制效果，均低于50%的抑制率。對照組1(加酶不加抑制分子)對CDC25A/CDC25B抑制率為100%，即無抑制作用，見表1。

表1 45種藏藥材提取物對CDC25A/B的抑制活性結(jié)果

*所得結(jié)果為3次試驗測得結(jié)果平均值。

4 討論

本試驗通過DC25A/CDC25B建立的高通量篩選模型進行體外酶抑制活性測定，篩選來自于15科32屬的45種藏藥材，其中小葉紅景天乙醇提取物對CDC25A磷酸酶有抑制活性。張敏等[11]紅景天提取物對體外培養(yǎng)肺癌細胞有明顯抑制作用，紅景天苷、紅景天加維甲酸能夠體外誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[12,13]。除此之外，11種藏藥材(防風(fēng)、荊芥、雪層杜鵑、鎖陽、側(cè)金盞、斑花黃堇、黑頂黃堇、條裂黃堇、尼泊爾黃堇、粗梗黃堇及柳蘭)對CDC25A和CDC25B磷酸酶有明顯的抑制效果。5種藏藥材(甘青烏頭、四數(shù)獐牙菜、鐵線蓮、小花刺參及雪蓮)只對CDC25B有明顯的抑制效果，除小葉紅景天外，上述有CDC25A/CDC25B磷酸酶抑制活性的均為首次報道。

通過對45種藏藥材乙醇提取物進行體外CDC25A/CDC25B磷酸酶抑制活性的初步篩，揭示這些藏藥材的抗腫瘤作用，同時為進一步開發(fā)利用藏藥材的抗腫瘤提供參考。

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