高志強，馬云，崔玉彬(濰坊醫(yī)學(xué)院附屬益都中心醫(yī)院，山東濰坊262500)

糖尿病腎病(DKD)是2型糖尿病(T2DM)的慢性并發(fā)癥之一，是終末期腎病的主要病因[1]。目前對DKD的發(fā)病機制尚不完全明確，慢性低度炎性反應(yīng)導(dǎo)致的腎纖維化被認(rèn)為是導(dǎo)致DKD發(fā)生及進展的重要機制。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是目前公認(rèn)的致器官纖維化作用最強的促纖維化始動因子，通過TGF-β1/Smads信號通路參與腎臟纖維化的調(diào)控，與DKD關(guān)系密切[2]。纖維黏連蛋白(FN)是一種主要的細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，研究表明，局部FN和膠原的堆積能夠促進腎纖維化的形成[3]。微小RNA(miR)-200c是miRNA家族重要成員之一，研究證實其與器官纖維化密切相關(guān)[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-200c在DKD小鼠腎小球中表達明顯增高，并且腎小球系膜細(xì)胞中的TGF-β1受miR-200c的正向調(diào)控[5]。但目前有關(guān)miR-200c在DKD患者血清中的表達情況及其與TGF-β1、FN的關(guān)系尚不明確。本研究觀察DKD患者miR-200c、TGF-β1及FN的表達水平，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年2月～2017年2月在我院治療的218例DKD患者患者為DKD組，其中男119例、女99例，年齡(56.09±13.05)歲，糖尿病病程(10.01±6.83)年。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合糖尿病腎病防治專家共識(2014年版)DKD診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②近期未發(fā)生糖尿病酮癥酸中毒；③無高血壓病史；④未使用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)類藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴心臟、肝臟及除DKD以外的其他腎臟疾??；②近期有各種感染性疾病。根據(jù)美國腎臟基金會-慢性腎臟病臨床實踐指南和糖尿病腎病防治專家共識(2014年版)，參照患者尿白蛋白/尿肌酐(UACR)將DKD組患者分為兩個水平，早期DKD(UACR為30～300 mg/g)120例和中晚期DKD(UACR>300 mg/g)98例。另隨機選擇同期性別、年齡相匹配的非DKD的T2DM患者142例作為單純T2DM組(UACR<30 mg/g)。隨機選擇同期性別、年齡相匹配的健康查體志愿者100例作為正常對照組(NC組)。收集所有受試者BMI、糖化血紅蛋白(HbA1c)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)等資料。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 血清標(biāo)本采集 患者于入院時、健康志愿者于體檢時分別采集空腹外周血5 mL，室溫靜置30 min后，離心取血清，-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 血清miR-200c水平檢測 采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法。嚴(yán)格按miRNeasy Serum/Plasma Kit(德國QIAGEN公司)試劑盒說明書提取血漿總RNA，利用分光光度計檢測總RNA濃度與純度，以D260/D280在1.8～2.1為合格標(biāo)準(zhǔn)。將提取的總RNA按照miScript Ⅱ RT Kit(德國QIAGEN公司)試劑盒說明書操作逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。應(yīng)用miScript SYBR Green PCR Kit(德國QIAGEN公司)對合成的cDNA進行實時定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 min，60 ℃ 1 min，共45個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算miR-200c的相對表達量。重復(fù)3次。

1.4 血清TGF-β1、FN水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血清TGF-β1、FN水平。

2 結(jié)果

2.1 各組血清miR-200c、TGF-β1、FN水平比較 單純T2DM組和DKD組血清miR-200c、TGF-β1及FN水平均高于NC組(P均<0.05)；DKD組血清miR-200c、TGF-β1及FN水平均高于單純T2DM組(P均<0.05)；中晚期DKD患者血清miR-200c、TGF-β1及FN水平均高于早期DKD患者(P均<0.05)。見表1。

表1 各組血清miR-200c、TGF-β1、FN水平比較

注：與NC組比較，*P<0.05；與單純T2DM組比較，﹟P<0.05；與早期DKD比較，△P<0.05。

2.2 血清miR-200c與TGF-β1、FN水平的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，血清miR-200c與TGF-β1、FN水平均呈正相關(guān)(r分別為0.874、0.675，P均<0.01)。

2.3 血清miR-200c的影響因素 多元逐步回歸分析顯示，UACR及TGF-β1是影響DKD患者血清miR-200c的獨立危險因素(P均<0.05)，回歸方程為YmiR-200c=12.984+2.187XTGF-β1+0.04XUACR。

3 討論

隨著T2DM發(fā)病率的不斷增高，糖尿病相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生率也隨之明顯增高，其中DKD是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥之一，是終末期腎病最主要的原因，其發(fā)病率和病死率逐年升高[7]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。終末期腎病患者預(yù)后較差，5年生存率<20%[8]。DKD以持續(xù)性蛋白尿、進展性腎小球濾過率降低以及血壓升高為特征，由于患者早期多無明顯癥狀，出現(xiàn)蛋白尿后病情已不可逆轉(zhuǎn)，因此尋找能夠早期發(fā)現(xiàn)及判斷DKD嚴(yán)重程度的血清生物學(xué)標(biāo)志物意義重大。

miRNA可以穩(wěn)定表達于血液或者其他體液中，在某些疾病狀態(tài)下，血液中miRNA的表達水平可以發(fā)生特異性改變[9]，可能為疾病的早期診斷提供新的方向。近年來越來越多證據(jù)表明，miRNA在DKD發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，起著促進或者抑制DKD發(fā)生發(fā)展的作用[10]。miR-200c是miR-200家族成員之一，其定位于染色體12p13.31[11]。miR-200c在腫瘤方面的研究較多，其在多種惡性腫瘤中表達減低，具有極強的抑癌基因活性，與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及化療藥物敏感性密切相關(guān)[12]。近期研究表明，miRNAs參與DKD發(fā)病機制中的信號通路的調(diào)節(jié)，與慢性低度炎癥反應(yīng)及細(xì)胞外基質(zhì)累積導(dǎo)致的腎臟纖維化有關(guān)[4]。動物實驗證實，DKD小鼠模型miR-200c的表達明顯增高[5,13]，提示miR-200c可能與DKD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，單純T2DM組和DKD組患者血清miR-200c水平高于NC組，并且DKD組血清miR-200c水平高于單純T2DM組，提示患者血清miR-200c水平的增高與DKD的發(fā)生有關(guān)，并且在患者出現(xiàn)DKD前患者miR-200c已經(jīng)升高，提示監(jiān)測糖尿病患者血清miR-200c水平有助于早期發(fā)現(xiàn)DKD。我們進一步通過亞組分析還發(fā)現(xiàn)，中晚期DKD患者血清miR-200c水平高于早期DKD患者，提示患者血清miR-200c水平與DKD的進展有關(guān)，監(jiān)測DKD患者血清miR-200c水平有助于早期判斷DKD患者的嚴(yán)重程度。

DKD發(fā)病機制非常復(fù)雜，其具體發(fā)病機制尚未完全闡明。慢性持續(xù)低度炎癥反應(yīng)和細(xì)胞外基質(zhì)累積是DKD發(fā)生進展的共同通路[14]。目前有關(guān)miR-200c在DKD發(fā)生發(fā)展中作用的具體機制尚不清楚。近期Kato等[5]發(fā)現(xiàn)，DKD小鼠腎小球系膜細(xì)胞中TGF-β1受miR-200c的正向調(diào)控。TGF-β1屬于轉(zhuǎn)化生長因子超家族成員，能夠促進腎臟纖維化，增加腎小球系膜細(xì)胞數(shù)量，促進細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，并且TGF-β1mRNA在DKD患者腎小球中表達水平隨腎小球硬化范圍的增加而增高，在DKD的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[15,16]。近期研究證實，高糖濃度能夠刺激腎小球系膜細(xì)胞FN的合成，并且這種效應(yīng)是由TGF-β1介導(dǎo)的[17]。FN是一種非膠原糖蛋白，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分，F(xiàn)N在DKD等腎小球疾病中含量增高，提示細(xì)胞外基質(zhì)纖維化發(fā)生[18]。FN mRNA水平隨著內(nèi)源性TGF-β1活性的增加而增加[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，單純T2DM組和DKD組血清TGF-β1和FN水平均高于NC組，DKD組血清TGF-β1和FN水平均高于單純T2DM組，并且中晚期DKD患者血清TGF-β1和FN水平均高于早期DKD患者，提示患者血清TGF-β1和FN水平與DKD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，血清中TGF-β1和FN水平能夠反映DKD的嚴(yán)重程度，與Ma等[20]研究結(jié)果一致。本研究中我們進一步通過Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-200c與TGF-β1、FN水平均呈正相關(guān)，并且多元逐步回歸分析顯示TGF-β1是影響血清miR-200c水平的獨立危險因素，證明miR-200c參與DKD發(fā)生發(fā)展的機制，可能與對TGF-β1、FN的調(diào)控有關(guān)。

綜上所述，miR-200c在DKD患者血清中表達增高，并且與血清TGF-β1、FN水平呈正相關(guān)。miR-200c可能通過對TGF-β1、FN的調(diào)控參與DKD的發(fā)生發(fā)展。

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