陳 超 趙笑東 張國興 尹學敏 陳競緯△

（1.上海中醫(yī)藥大學，上海 200120；2.江蘇省蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215009；3.蘇州大學，江蘇 蘇州 215009）

血管內皮細胞在維持正常的血管功能方面發(fā)揮著重要作用，多種因素致血管內皮損傷是動脈粥樣硬化（As）發(fā)生和發(fā)展的始動環(huán)節(jié)［1］。腎素-血管緊張素系統(tǒng)是體內重要的體液調節(jié)系統(tǒng)，參與維持心血管功能穩(wěn)態(tài)。有研究表明高濃度血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）會破壞血管內皮細胞的屏障功能，抑制血管舒張和收縮，參與As 的進程［2-3］。 范俊等研究者［4-5］進一步發(fā)現(xiàn) AngⅡ刺激內皮細胞后，血管內皮的變化與AngⅡ誘導的細胞自噬有關。在As的發(fā)病過程中，一定程度的自噬能促進斑塊穩(wěn)定，而過量自噬則可能導致細胞死亡，促進As發(fā)生發(fā)展［6］。吳門調脂顆粒是由蒲黃、姜黃、澤瀉3味中藥按照一定比例配伍提取而成，臨床療效頗豐。前期的臨床及實驗室研究表明調脂顆粒能加快脂質的代謝和轉運［7-9］。筆者最新研究還發(fā)現(xiàn)調脂顆粒對細胞自噬起到雙向調節(jié)作用［10］。因此本研究旨在闡明調脂顆粒在AngⅡ誘導細胞自噬中的作用，從而探討調脂顆粒在抗As中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與動物 人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）由蘇州大學血液研究所提供）。40只SD大鼠，雌雄各半，體質量（200±10） g，無特定病原體（SPF）級，由蘇州大學醫(yī)學部實驗動物中心提供，許可證號：SYXK（蘇）2017-0043。飼養(yǎng)條件如下：5 只 1籠，溫度（25±2） ℃，濕度50%～60%，通風良好，自由攝食飲水，勤換墊料。

1.2 試藥與儀器 調脂顆粒購自蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，批號：150915；DMEM 培養(yǎng)基購自 Gibco公司，批號：22016004；胎牛血清購自普飛生物公司，批號：1A2375；LC3B抗體（免疫熒光）購自 Novus公司，批號：32011；beclin-1抗體購自Abcam公司，批號：GR261694-5；P62抗體購自CST公司，批號：NO005；胰酶細胞消化液，批號：C0201；裂解液（中），批號：P0013C；DMSO，批號：s7038；MTT試劑盒，批號：C0009；AngⅡ，批號：SLBF7813V；明膠，批號：G8060；LC3B 抗體（Western blot），批號：046M4787V，均購自 Sigma 公司。HRP anti-Rabbit，批號：72234394；HRP anti-Mouse，批號：72233063均購自杭州聯(lián)科生物科技有限公司。SW-CJ-2FD雙人單面垂直流超凈工作臺，購自蘇州光源凈化科技有限公司；BB15 CO2培養(yǎng)箱，Multiskan酶標儀，Microcl 2R低溫高速離心機均購自Thermo公司。

1.3 調脂顆粒含藥血清的制備 將40只雌雄各半的SD大鼠隨機分為兩組，調脂顆粒組22只和空白對照組18只。按人-大鼠體表面積比值折算大鼠的等效劑量［11］，調脂顆粒組按照臨床等效劑量的3倍濃度，得出大鼠灌胃藥物濃度為0.06 g/kg［11］。按照實驗要求，連續(xù)3 d，每日2次，調脂顆粒組大鼠灌胃2 mL調脂顆粒，空白對照組大鼠灌胃2 mL 0.9%氯化鈉注射液。第4天灌胃1 h后乙醚麻醉，消毒，于超凈工作臺內腹主動脈取血，靜置分層，離心，抽取血清，混勻，滅活，分裝后置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 內皮細胞的培養(yǎng)及分組 內皮細胞以含10%胎牛血清配置的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，定期更換培養(yǎng)液，保證細胞生長狀態(tài)良好。待細胞鋪滿至80%～90%，吸棄培養(yǎng)基，胰酶消化液消化、收集、離心、傳代。傳2～3代后用于實驗分組，將內皮細胞分為空白對照組、調脂顆粒低、中、高劑量預處理組和AngⅡ組共5組。調脂顆粒低、中、高劑量預處理組分別加入適量的調脂顆粒含藥血清（低劑量大鼠含藥血清制備為1%含藥血清∶9%空白血清∶90%完全培養(yǎng)基；中劑量大鼠含藥血清制備為3%含藥血清∶7%空白血清∶90%完全培養(yǎng)基；高劑量大鼠含藥血清制備為9%含藥血清∶1%空白血清∶90%完全培養(yǎng)基）預處理30 min后，根據(jù)實驗要求加入終濃度為10-7mmol/L的AngⅡ培養(yǎng) 24 h。

1.5 觀察項目 1）MTT比色法測定細胞活性。對傳代至96孔板中生長面積為60%～70%血管內皮細胞，根據(jù)實驗分組分別加入相應的藥物，每組設3個復孔，培養(yǎng) 24 h 后加入 10 μL MTT 溶液（5 mg/mL），孵育 4 h后加入100 μL Formazan溶解液，繼續(xù)培養(yǎng)直至普通光學顯微鏡下Formazan全部溶解，酶標儀570 nm波長測定吸光度。 2）Western blot檢測 LC3-Ⅱ、beclin-1、SQSTM1/p62的表達。內皮細胞根據(jù)實驗分組加入相應藥物處理24 h，取適量的裂解液（每1 mL裂解液加10 μL PMSF）裂解 10 min，超聲粉碎細胞 5～6 次，離心，收取上清，BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。SDS聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白電泳，蛋白分離后300 mA，60 min轉膜至PVDF膜上。室溫下5%脫脂奶粉封閉孵育2 h，用相應的Ⅰ抗4℃孵育過夜，洗滌用HRP標記Ⅱ抗室溫孵育1～1.5 h。于凝膠成像儀下顯影，使用Image J的軟件計算條帶灰度值。3）免疫熒光法檢測細胞內自噬小體的數(shù)量變化。將載玻片用0.1%明膠包被后放入24孔板，接種細胞常規(guī)培養(yǎng)，按各分組加入藥物處理 24 h。PBS洗3遍后以1∶1丙酮∶甲醇固定液固定15 min， 以 0.1%Triton X-100避光孵育 10 min，1%BSA 封閉 60 min，以一抗（1∶1000稀釋比）4 ℃過夜，以二抗（1∶1000稀釋比） 孵育 60 min，DAPI避光孵育10 min，用 50 μL 濃度為 50%、75%、95%、100%的乙醇依次脫水，封片、固定、室溫干燥后于激光共聚焦顯微鏡下觀察。4）NO含量測定。將內皮細胞以各藥物相應處理24 h后，加入NO專用裂解液裂解細胞，破碎離心后收集上清，使用總NO檢測試劑盒檢測NO濃度，BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，最終用NO濃度除以蛋白濃度，即為每毫克蛋白里NO濃度。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析和t檢驗分析，計數(shù)資料采用等級資料的秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 AngⅡ及調脂顆粒聯(lián)合AngⅡ處理24 h對內皮細胞生存率（活力）的影響 見表1。待96孔板中內皮細胞鋪滿至70%～80%時，用AngⅡ（10-7mmol/L）及調脂顆粒聯(lián)合AngⅡ處理24 h后進行MTT實驗。結果如表1、圖1，可見以AngⅡ刺激內皮細胞 24 h，吸光度與空白組沒有明顯差異；調脂顆粒含藥血清預處理組與AngⅡ組及空白組比差異也沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），這表明加入各藥物24 h后未造成細胞死亡，細胞生存率沒有受到影響。

表1 各組血管內皮細胞生存率（活力）比較（±s）

表1 各組血管內皮細胞生存率（活力）比較（±s）

與空白對照組比較，*P＜0.05；與AngⅡ組比較，△P＜0.05。下同。

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圖1 各組血管內皮細胞生存率（活力）比較

2.2 AngⅡ及調脂顆粒聯(lián)合AngⅡ對血管內皮細胞自噬的影響 對6孔板中血管內皮細胞分別用AngⅡ及調脂顆粒含藥血清聯(lián)合AngⅡ處理24 h后，Western blot檢測LC3-Ⅱ、beclin-1、p62表達量的變化。結果如圖2、表2，AngⅡ組與空白對照組相比，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin-1表達量增多，p62表達量降低（P＜0.05），自噬總水平上升，提示AngⅡ誘導細胞自噬。和AngⅡ組相比，調脂顆粒低、中、高劑量組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin-1表達量減少，調脂顆粒中劑量組和高劑量組p62表達量升高（P＜0.05），調脂顆粒低劑量組p62表達量較AngⅡ組差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。提示調脂顆粒能抑制AngⅡ誘導的細胞自噬增加。

圖2 各組LC3、beclin-1、p62蛋白表達比較

表2 各組 LC3、beclin-1、p62 蛋白表達比較（±s）

表2 各組 LC3、beclin-1、p62 蛋白表達比較（±s）

組 別 n空白對照組 6 AngⅡ組 6調脂顆粒低劑量組 6調脂顆粒中劑量組 6調脂顆粒高劑量組 6 LC3蛋白1.0000±0.0000 1.3300±0.0529*0.6925±0.1212△0.6425±0.0822△0.7525±0.1307△beclin-1蛋白 p62蛋白1.0000±0.0000 1.0000±0.0000 1.4475±0.1839* 0.7850±0.1266*0.8600±0.0583△ 1.2075±0.1987 0.6975±0.0793△ 1.3450±0.1690△0.8350±0.0714△ 1.1675±0.2216△

2.3 自噬小體免疫熒光結果 AngⅡ及調脂顆粒含藥血清聯(lián)合AngⅡ處理血管內皮細胞24 h，免疫熒光標記LC3B蛋白，圖中胞質內綠色熒光小點即是自噬小體。計算不同組別的細胞內自噬小體數(shù)目，結果如圖3、表3?？瞻讓φ战M未見明顯自噬小體，AngⅡ組較空白組自噬小體數(shù)量明顯增多（P＜0.05）。而調脂顆粒含藥血清聯(lián)合AngⅡ組自噬小體數(shù)量較AngⅡ組明顯減少（P＜0.05），調脂顆粒低中高劑量組自噬小體數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。據(jù)此提示AngⅡ能誘導血管內皮細胞的自噬水平上調，而調脂顆粒則能抑制AngⅡ誘導的血管內皮細胞的自噬水平上調。

圖3 各組自噬小體的數(shù)目變化比較

2.4 NO含量檢測 相應藥物刺激24 h后，用NO總試劑盒檢測NO含量，經統(tǒng)計后結果如圖4、表4。AngⅡ組較空白組NO含量明顯降低（P＜0.05）。而調脂顆粒低劑量與中劑量聯(lián)合AngⅡ組NO含量較AngⅡ組明顯升高（P＜0.05）；而調脂顆粒高劑量聯(lián)合AngⅡ組NO含量較AngⅡ組差異無統(tǒng)計學意義。調脂顆粒低、中、高劑量組間NO含量差異無統(tǒng)計學意義。提示AngⅡ降低NO含量，可能引起血管內皮細胞自噬水平上調；而調脂顆粒預處理組則可能通過上調NO水平抑制AngⅡ誘導的細胞自噬增多。

表3 各組自噬小體的數(shù)目變化比較（±s）

表3 各組自噬小體的數(shù)目變化比較（±s）

組 別 n空白對照組 6 AngⅡ組 6調脂顆粒低劑量組 6自噬小體0.1667±0.3727 4.8333±1.0672*0.6667±0.7454△調脂顆粒中劑量組 6 0.5000±0.5000△調脂顆粒高劑量組 6 0.6667±0.7454△

圖4 各組NO含量比較

表4 各組NO含量比較（±s）

表4 各組NO含量比較（±s）

組 別 n空白對照組 6 AngⅡ組 6調脂顆粒低劑量組 6 NO 1 0.7881±0.2039*1.4084±0.2885△調脂顆粒中劑量組 6 1.2686±0.2250△調脂顆粒高劑量組 6 1.2782±0.2741△

3 討 論

隨著社會發(fā)展和物質生活水平的提高，人們飲食結構及生活習慣的不斷變化，As的發(fā)病率也日益升高，由As引發(fā)的心血管疾病仍然是導致人類死亡的主要原因之一。目前現(xiàn)代醫(yī)學主要采取調脂、抗氧化應激等方法防治As及相關疾病，在臨床上取得了一定成效。但西藥花費多，并存在藥物過敏、肝腎功能損害等副作用，制約著其在臨床上的普及應用。中醫(yī)藥具有多途徑、多靶點作用，為有效防治AS提供了可行性。

中醫(yī)學并沒有As這一病名，根據(jù)其癥狀、體征，當屬眩暈、痰濁、血瘀的范疇。吳門醫(yī)派是傳統(tǒng)中醫(yī)重要學術流派之一，在中醫(yī)學史上有著濃墨重彩的一筆，溫病學說是其核心內涵。蘇州市中醫(yī)醫(yī)院已故名老中醫(yī)汪達成主任醫(yī)師結合多年臨床經驗以及吳門醫(yī)派學術思想，并根據(jù)吳中地域多濕，經濟發(fā)達，生活水平高這一地域特點，認為As因多由飲食不節(jié)，嗜食肥甘；七情內傷，氣機不暢；年老體弱，腎精虧虛；這些均可導致肝、脾、腎臟腑功能失調，釀生痰濁，導致氣機不暢，血行瘀滯。痰濁、瘀血膠著脈道，終致痰瘀阻絡發(fā)而為病。病機以肝、脾、腎功能失調為本，痰濁、瘀血為標，并以“化痰祛瘀”理論為指導，創(chuàng)制調脂顆粒方，方用蒲黃、姜黃、澤瀉3味中藥，其中蒲黃為君，化痰活血升清泌濁；澤瀉為臣，利水化濕，通腎之開合；姜黃兼佐使，理氣疏肝，活血化癖，諸藥兼顧化痰行血降脂，物美價廉，療效頗豐，臨床實踐及實驗室研究均表明蘇州市中醫(yī)醫(yī)院調脂顆粒能夠降血脂，在As治療中扮演著重要角色。

自噬是真核細胞中普遍存在的一種生命現(xiàn)象，其清除變性錯誤折疊的氧化蛋白和老化受損的細胞器，有利于維持細胞的穩(wěn)態(tài)［12］。在自噬過程中beclin-1作為構成Ⅲ類PI3K復合體的支架蛋白，與其他蛋白結合構成復合體，啟動自噬［13］；LC3-Ⅰ在自噬基因的作用下，與磷脂酰乙醇胺共價結合在自噬體膜上形成LC3-Ⅱ后被溶酶體酶降解，LC3-Ⅱ是目前反映細胞內自噬水平的標記蛋白［14］。SQSTM1/p62是自噬體膜的受體蛋白，與自噬活性呈負相關性，反映自噬溶酶體溶解酶活性和自噬流的強弱［15］。本實驗通過Western blot檢測自噬相關蛋白 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin-1、SQSTM1/p62的表達及細胞免疫熒光觀察細胞內自噬小體的數(shù)目變化，發(fā)現(xiàn)AngⅡ對血管內皮細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin-1蛋白表達有促進作用，對SQSTM1/p62蛋白表達有降低作用，并能促進自噬小體數(shù)目增多，以上結果均證明AngⅡ夠誘導血管內皮細胞發(fā)生自噬。目前認為AngⅡ通過其Ⅰ型受體產生大量的ROS，從而引起氧化應激導致了內皮功能損傷［16］。本實驗AngⅡ組的NO含量和空白對照組相比明顯下降，表明AngⅡ誘導的內皮細胞自噬可能與NO含量降低有關。本實驗發(fā)現(xiàn)調脂顆粒組能減少AngⅡ誘導的血管內皮細胞自噬相關蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin-1表達，促進SQSTM1/p62表達增加，抑制自噬體生成，同時NO含量明顯增多。這表明調脂顆粒能夠抑制AngⅡ誘導的血管內皮細胞自噬，其機制可能與增加NO表達量有關。

本研究中，調脂顆粒預處理組低中高劑量均對AngⅡ誘導的內皮細胞自噬水平升高起到抑制作用，但低、中、高劑量組間差異無統(tǒng)計學意義，猜測可能與劑量比例有關，接下來的實驗則可以通過調整低、中、高劑量比例找到調脂顆粒含藥血清干預AngⅡ誘導內皮細胞自噬的最佳濃度，以便更好指導臨床工作。

近年來，自噬與心血管疾病的關系越來越受到人們的關注，相應的中醫(yī)藥研究也越來越多，此次實驗是在既往對調脂顆粒研究的基礎之上，深度探索調脂顆粒干預As新機制可能與干預血管內皮細胞自噬水平增加有關，能更好繼承和發(fā)揚吳門醫(yī)派的學術經驗，服務社會，造福大眾。

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