趙文博 李心亮 奚劍敏 蔡增博 唐雅琳 祖攀寧 唐沛蘭 趙瑞成△

（1.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410006；2.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥藥理毒理實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410013；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

張崇泉教授為湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院資深專家、老年病和心血管病學(xué)術(shù)帶頭人，主任醫(yī)師，享受政府特殊津貼專家，第3批及第4批全國(guó)名老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)傳承工作指導(dǎo)老師［1］。通信作者趙瑞成主任醫(yī)師為張崇泉教授第4批學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承人，帶領(lǐng)研究生團(tuán)隊(duì)參加“張崇泉名老中醫(yī)藥專家傳承工作室”工作，重點(diǎn)整理與研究張崇泉教授治療心腦血管病經(jīng)驗(yàn)［2-4］。鉤芍降壓顆粒為張崇泉教授經(jīng)驗(yàn)方，上世紀(jì)90年代，經(jīng)臨床研究驗(yàn)證，鉤芍降壓顆粒具有緩慢持久的降壓效果［5］，能改善左心室舒張功能［6］。近年來，臨床研究與實(shí)驗(yàn)觀察，發(fā)現(xiàn)鉤芍降壓顆粒可以改善缺血性中風(fēng)神經(jīng)功能缺損［7］，通過保護(hù)血管內(nèi)膜，具有抗動(dòng)脈硬化作用［8］，但其作用機(jī)制不清楚。本文就鉤芍降壓顆粒的降壓機(jī)制進(jìn)行如下研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SHR大鼠30只，體質(zhì)量174～253 g；雄性 Wistar大鼠 10只，體質(zhì)量 186～220 g，均 6周齡，由湖南省中醫(yī)藥研究院中藥藥理毒理實(shí)驗(yàn)室購(gòu)自上海斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：2015000518364。大鼠飼養(yǎng)在湖南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，正常飲食，室溫20～25℃，適量通風(fēng)，適應(yīng)環(huán)境1周。

1.2 試藥與儀器 1）鉤芍降壓顆粒組成：鉤藤30 g，白芍 20 g，地龍 10 g，生地黃 20 g，葛根 15 g，川牛膝10 g，澤瀉10 g。全部為中藥免煎顆粒，由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司生產(chǎn)。2）厄貝沙坦片，進(jìn)口藥品，注冊(cè)證號(hào)H20140006，進(jìn)口藥品分類批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字 J20130049，規(guī)格 150 mg/片。2）儀器：PB1502電子天平、BP-6無創(chuàng)血壓計(jì)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湘儀H1650R）、全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)（匯松PW-812）、多功能酶標(biāo)分析儀（匯松MB-530）、恒溫培養(yǎng)箱（光明 DHP-500）、自動(dòng)平衡離心機(jī)（湘儀 L530）。

1.3 分組及給藥 30只SHR大鼠，依據(jù)給藥前血壓隨機(jī)分為模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，每組10只，另雄性Wistar大鼠10只作為空白對(duì)照組。依據(jù)體質(zhì)量灌胃給藥，陽性對(duì)照組予厄貝沙坦（厄貝沙坦150 mg溶于192 mL蒸餾水，每只大鼠每次灌胃4 mL），實(shí)驗(yàn)組予鉤芍降壓顆粒（鉤芍降壓顆粒溶于200 mL蒸餾水，每只大鼠每次灌胃4 mL）、模型對(duì)照組與空白對(duì)照組予等量蒸餾水。每日1次，連續(xù)4周。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）采用無創(chuàng)血壓計(jì)測(cè)量大鼠動(dòng)脈收縮壓，灌胃前和灌胃2、4周后，各測(cè)1次。2）末次給藥后，將大鼠禁食不禁水24 h，稱質(zhì)量，10%水合氯醛麻醉，肝素鈉抗凝管，腹主動(dòng)脈取血4 mL，3000 r/mim離心5 min后取上清液。各種試劑移至室溫（18～25℃）平衡至少30 min。分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣本孔，每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本100 μL，輕輕晃動(dòng)混勻，覆上板貼，置37℃溫育2 h。棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100 μL，覆上新的板貼，置37℃溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次。每次浸泡2 min，200 μL每孔，甩干。每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100 μL，覆上新的板貼，置37℃溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。每次浸泡2 min，200 μL每孔，甩干。依序每孔加底物溶液90 μL，37℃避光顯色15 min。依序每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。在反應(yīng)終止后5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。3）大鼠處死，鈍性分離腎動(dòng)脈，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，脫蠟和水化后，PBS洗兩次各5 min。用于甲醛固定石蠟包埋組織切片。水浴鍋加熱0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液至95℃，放入組織切片加熱15 min，加熱完畢用自來水冷卻至室溫，取出。PBS洗5 min。滴加封閉液，室溫5 min。滴加一抗，4℃過夜，PBS洗3次每次2 min。滴加羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體，室溫孵育1 h。PBS洗3次每次2 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染20 s，蒸餾水洗2次每次2 min。脫水后放入100%二甲苯10 min透明。拍照分析鈣敏感受體（CaSR）表達(dá)。每張切片隨機(jī)抓取400倍的視野，根據(jù)細(xì)胞核染色為藍(lán)色，統(tǒng)計(jì)視野中總細(xì)胞數(shù)，根據(jù)CaSR陽性信號(hào)染色統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)均以（±s）表示，資料滿足正態(tài)分布及方差齊性，組間比較采用成組t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血壓比較 見表1。空白對(duì)照組組內(nèi)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型對(duì)照組組內(nèi)比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；陽性對(duì)照組組內(nèi)比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)組組內(nèi)比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。組間比較，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；陽性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 各組大鼠血壓比較（mmHg，±s）

表1 各組大鼠血壓比較（mmHg，±s）

與本組實(shí)驗(yàn)前比較，*P＜0.05；與空白對(duì)照組同時(shí)期比較，△P＜0.05。下同。

組 別 n 灌胃4周后實(shí)驗(yàn)前 灌胃2周后空白對(duì)照組 10 122.00±4.90模型對(duì)照組 10 190.00±4.60*陽性對(duì)照組 10 125.00±2.80 121.00±6.31 122.00±5.22 160.00±4.20 173.00±3.62 162.00±4.90 123.00±3.32實(shí)驗(yàn)組 10 144.00±2.50*162.00±6.60 162.00±6.94

2.2 各組血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）含量測(cè)定 見表2。灌胃4周，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清中AngⅡ含量，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；陽性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組與陽性對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組血清AngⅡ含量比較（pg/mL，±s）

表2 各組血清AngⅡ含量比較（pg/mL，±s）

組 別 n AngⅡ空白對(duì)照組 10模型對(duì)照組 10陽性對(duì)照組 10 7.46±2.69 18.15±1.83*11.81±3.75*實(shí)驗(yàn)組 1010.13±3.53

2.3 各組腎動(dòng)脈CaSR表達(dá)比較 見表3，圖1。灌胃4周，免疫組化法檢測(cè)腎動(dòng)脈CaSR免疫組化表達(dá)（見表3）。模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；陽性對(duì)照組空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)組與模型對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組腎動(dòng)脈CaSR表達(dá)比較（n，%）

圖1 各組腎動(dòng)脈CaSR表達(dá)（免疫組化染色，400倍）

3 討 論

高血壓發(fā)病機(jī)制中，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）在調(diào)節(jié)水鹽代謝維持血容量與血管張力以及調(diào)控心血管、腎臟功能等方面起著極其重要的作用。本課題實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，實(shí)驗(yàn)組血清AngⅡ含量與空白對(duì)照組相當(dāng)，低于模型對(duì)照組，與陽性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示鉤芍降壓顆?？梢越档脱錋ngⅡ含量。

CaSR是G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）C家族的成員，其在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、胃腸道、腎臟及骨組織中有廣泛的分布，當(dāng)與激動(dòng)劑及變構(gòu)調(diào)節(jié)劑結(jié)合后，激活下游相關(guān)信號(hào)通路，對(duì)于機(jī)體鈣離子（Ca2+）穩(wěn)態(tài)的維持具有重要調(diào)節(jié)作用［9］。1993年，Brown等首次在牛甲狀旁腺中克隆出細(xì)胞外CaSR，并證實(shí)細(xì)胞外鈣（［Ca2+］o）發(fā)揮著第一信使的作用［10］。 增加［Ca2+］o 可通過膜的穩(wěn)定效應(yīng)而導(dǎo)致血管的松弛，其機(jī)制與鈣敏感受體（CaSR）有關(guān)［11］。 Ca2+是細(xì)胞內(nèi)最普遍、最重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成分，而且在細(xì)胞內(nèi)外維持一定的濃度差。細(xì)胞內(nèi)鈣離子（［Ca2+］i） 濃度的升高主要通過胞內(nèi)Ca2+釋放和［Ca2+］o 內(nèi)流兩大途徑，而［Ca2+］o 內(nèi)流在傳遞細(xì)胞信息方面更為重要。血管內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)Ca2+內(nèi)流能釋放舒張因子一氧化氮（NO）以維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。激活CaSR 可引起［Ca2+］i升高及 NO 生成［12］。 本研究證實(shí)，鉤芍降壓顆?？梢栽鰪?qiáng)SHR大鼠腎動(dòng)脈CaSR表達(dá)。

Smajilovic等在1篇綜述中對(duì)CaSR在血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要生理作用進(jìn)行了歸納總結(jié)，［Ca2+］o激活CaSR而產(chǎn)生降血壓作用的可能機(jī)制是通過抑制腎臟腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活［13］。之后，又有學(xué)者對(duì)擬鈣劑降低血壓的機(jī)制進(jìn)行了研究，認(rèn)為甲狀旁腺中的CaSR激活后，可抑制腎素的分泌，進(jìn)而降低血管緊張素Ⅱ和醛固酮的水平，使血壓降低機(jī)制占主導(dǎo)作用［14］。盡管，CaSR在腎素-血管緊張素系統(tǒng)作用沒有完全闡明，但CaSR對(duì)血壓的調(diào)節(jié)作用是肯定的，隨著研究的深入，CaSR更多的作用機(jī)制將被揭示。

鉤芍降壓顆粒由鉤藤、生白芍、生地黃、葛根、干地龍、丹參、川牛膝、澤瀉組成，方中鉤藤清熱平肝，息風(fēng)解痙；生白芍養(yǎng)血柔肝，斂陰抑陽為君藥；生地黃、葛根養(yǎng)陰舒筋；干地龍、丹參、川牛膝活血通絡(luò)，澤瀉引經(jīng)歸腎，利尿降濁［6］。諸藥共奏滋陰平肝、活血通絡(luò)之效。在高血壓發(fā)病機(jī)制中“腎動(dòng)脈痙攣狹窄”可引起的腎素血管緊張素系統(tǒng)活性增加。鉤芍降壓顆粒組方原則立足滋陰平肝，活血通絡(luò)，而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“腎動(dòng)脈痙攣狹窄”類似于中醫(yī)“絡(luò)脈拙急”，故鉤芍降壓顆粒的作用契合“腎動(dòng)脈痙攣狹窄”病機(jī)。

本研究證實(shí)，鉤芍降壓顆粒可以降低自發(fā)性高血壓大鼠血清AngⅡ含量，為其降壓機(jī)制之一。同時(shí)活化腎動(dòng)脈CaSR，盡管CaSR在高血壓發(fā)病機(jī)制研究尚不深入，但與AngⅡ作用相關(guān)是肯定的，例如，已有研究證實(shí)CaSR參與了AngⅡ誘導(dǎo)大鼠心肌H9c2細(xì)胞肥大［15］。鉤芍降壓顆?？赡芡ㄟ^活化腎動(dòng)脈 CaSR緩解“腎動(dòng)脈痙攣”而降低了AngⅡ含量，但需進(jìn)一步研究證實(shí)。

（鳴謝：感謝張崇泉教授提供科研處方及在課題設(shè)計(jì)中給予的指導(dǎo)！）

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