石 磊 韓亞飛 劉佳麗 丁龐華 孫中美原文靜 郭 一 賈博宜 陳曉偉 李軍祥△

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種好發(fā)于結(jié)直腸黏膜、黏膜下層的非特異性炎癥性疾病，是炎癥性腸病的主要類型之一。臨床上以腹瀉、黏液膿血便、里急后重等腸道表現(xiàn)為主，同時(shí)可能伴有營(yíng)養(yǎng)不良、焦慮抑郁或多系統(tǒng)不同的腸外表現(xiàn)，病情嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)威脅生命的情況。UC的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為是由于環(huán)境、感染等因素刺激，引起遺傳易感的宿主發(fā)生不恰當(dāng)?shù)拿庖哐装Y反應(yīng)從而發(fā)病［1］，而免疫因素在UC的發(fā)病中起主導(dǎo)作用，甚至不少學(xué)者認(rèn)為UC屬于自身免疫性疾病，其中，T細(xì)胞的Th1/Th2亞群平衡失調(diào)可能是UC發(fā)病的重要機(jī)制之一。根據(jù)T細(xì)胞介導(dǎo)免疫功能及分泌的細(xì)胞因子不同，可以將T細(xì)胞分為Th1和Th2兩個(gè)主要的亞群，前者主要分泌IFN-γ、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）等因子介導(dǎo)細(xì)胞免疫和炎癥反應(yīng)；后者通過(guò)分泌白介素-4（IL-4）、白介素-5（IL-5）和白介素-13（IL-13）等介導(dǎo)體液免疫和抗炎反應(yīng)［2］。兩者在健康個(gè)體的體內(nèi)維持著動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)一方過(guò)度優(yōu)勢(shì)等情況致使平衡失調(diào)，則會(huì)誘發(fā)UC的發(fā)生。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)清腸溫中方可以明顯改善UC患者的病情，降低疾病活動(dòng)指數(shù)和修復(fù)腸黏膜，并對(duì)DSS誘導(dǎo)的急性UC大鼠有一定的治療作用。因此本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)小鼠慢性UC模型，觀察清腸溫中方對(duì)Th1/Th2平衡的干預(yù)作用，為清腸溫中方尋找可能的免疫作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性BALB/c小鼠90只，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房，12 h光照/12 h黑夜循環(huán)，溫度（22±2）℃，濕度 50%～60%，自由飲食飲水。

1.2 試藥與儀器 清腸溫中浸膏方（黃連6 g，炮姜10 g，三七6 g，木香6 g，炙甘草6 g等）由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供；陽(yáng)性對(duì)照藥美沙拉嗪緩釋顆粒（艾迪莎，國(guó)藥準(zhǔn)字H20143164）購(gòu)自北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院外購(gòu)藥房；葡聚糖硫酸鈉（DDS，160110，相對(duì)分子質(zhì)量36000～50000）購(gòu)自美國(guó)MP Bio公司；便潛血試劑盒（中國(guó)珠海，BA-0202B）、4%多聚甲醛（SL1830）購(gòu)自中農(nóng)博信（北京）科技有限公司；小鼠IL-1β（EK0394）、IL-4（EK0405）、IL-5（EK0408）、IL-6（EK0411）、TNF-α（EK0527）酶聯(lián)免疫吸附 ELISA 試劑盒均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；抗NF-κB p50（ab28849）抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 分組與造模 BALB/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字表法將90只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、清腸溫中方高劑量組（3.2 g浸膏/kg，臨床患者2倍用藥量）、清腸溫中方中劑量組（1.6 g浸膏/kg，臨床患者正常用藥量）、清腸溫中低劑量組（0.8 g浸膏/kg，臨床患者0.5倍用藥量）和美沙拉嗪組（606.7 mg/kg，臨床患者正常用藥量）共6組，每組15只，結(jié)合文獻(xiàn)［3］和臨床患者用藥量確定給藥劑量。采用改良的自由飲用 3%（w/v）DSS 方法復(fù)制慢性 UC 模型［4］。所有小鼠進(jìn)食普通維持飼料，空白組小鼠實(shí)驗(yàn)期間均不予干預(yù)，其余小鼠自由飲用由蒸餾水配置的3%DSS溶液，溶液每天新鮮配置，共7 d。第8天起改為飲用蒸餾水，共7 d，以上14 d為1個(gè)周期，整個(gè)模型復(fù)制階段共3個(gè)周期，合計(jì)42 d。第43天起所有小鼠飲用蒸餾水，同時(shí)連續(xù)14 d給予相應(yīng)藥物灌胃干預(yù)（0.1 mL/10 g），模型組用蒸餾水進(jìn)行對(duì)照灌胃。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）［5］。實(shí)驗(yàn)期間每天記錄小鼠體質(zhì)量，觀察一般情況和便質(zhì)，化驗(yàn)便潛血。體質(zhì)量下降率：無(wú)下降記0分；1%～5%記1分；5%～10%記2分；10%～15%記3分；大于15%記4分。便質(zhì)：正常0分，稀軟便2分；水樣便4分；便潛血：陰性0分；陽(yáng)性2分；肉眼血便4分。2）血清細(xì)胞因子含量。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)采用眼球取血，將小鼠一側(cè)胡須減去，充分暴露該側(cè)眼球，用眼科鑷摘除眼球，收集血液標(biāo)本，靜置 1 h，低溫離心機(jī)離心 15 min（3000 r/min），收集淡黃色透亮血清，分裝后冷凍備用。3）NF-κB p50蛋白表達(dá)。在裝有碎冰的培養(yǎng)皿上取距肛門4 cm處結(jié)腸標(biāo)本1 cm，于4%多聚甲醛溶液固定，石蠟切片包埋，4 μm切片，抗原修復(fù)后采用DAB顯色法免疫組化染色觀察NF-κB p50蛋白表達(dá)。采用平均光密度值（AOD＝IntDen/Area）代表 NF-κB p50 蛋白的具體染色程度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用（±s）描述，用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，方差齊用LSD檢驗(yàn)，不齊用T2檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01認(rèn)為有顯著差異。計(jì)數(shù)資料、等級(jí)資料用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）描述，用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)的K-W H檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01為有顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠DAI評(píng)分及一般情況比較 見(jiàn)表1。隨著飲用DSS溶液時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠出現(xiàn)腹瀉、黏液膿便、甚至肉眼血便的癥狀加重，同時(shí)伴有體質(zhì)量逐漸減輕，且癥狀在飲用藥物3 d后明顯加重。在造模第1周期內(nèi)小鼠癥狀表現(xiàn)明顯，病情嚴(yán)重，每組均有死亡現(xiàn)象發(fā)生，后2個(gè)周期的癥狀表現(xiàn)較前均有所減輕，死亡數(shù)量也較前減少。藥物干預(yù)后除模型組外，各組小鼠便血、腹瀉癥狀有不同程度減輕，體質(zhì)量逐漸恢復(fù)并增加，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)DAI評(píng)分結(jié)果提示模型組疾病程度明顯重于空白組（P＜0.01），清腸溫中方和美沙拉嗪干預(yù)后的評(píng)分均有所降低（P＜0.05）。

表1 各組DAI評(píng)分比較（分）

2.2 各組小鼠血清細(xì)胞因子含量比較 見(jiàn)表2。與空白組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β明顯升高（P＜0.01），IL-4和 IL-5明顯減少（P＜0.01）。藥物干預(yù)后各組與模型組相比，清腸溫中方各劑量和美沙拉嗪均能降低 TNF-α、IL-6 和 IL-1β（P＜0.05）并增加IL-4和IL-5（P＜0.05），其中以清腸溫中方中劑量組和美沙拉嗪組作用最明顯。

表2 各組小鼠血清細(xì)胞因子含量比較（pg/mL，±s）

表2 各組小鼠血清細(xì)胞因子含量比較（pg/mL，±s）

組 別 n IL-6 IL-1β 204.44±11.63 263.15±55.47 481.22±25.52*634.14±58.76*262.68±17.89△ 281.38±21.65△清腸溫中方中劑量組 10 220.77±18.98△ 533.46±26.85△ 499.65±30.38△ 245.75±20.00△ 275.74±55.20△清腸溫中方低劑量組 9 276.26±18.25△ 523.60±50.71△ 448.18±29.04△ 283.62±12.53△ 299.92±38.54△美沙拉嗪組 10 211.87±38.97△ 532.76±34.91△ 493.70±36.23△ 247.96±13.23△ 276.71±24.35△空白組 15模型組 8清腸溫中方高劑量組 9 TNF-α IL-4 IL-5 199.32±12.65 567.83±40.38 569.57±15.53 397.00±60.08*291.19±51.32*330.05±34.49*247.08±37.23△ 526.72±53.60△ 460.78±24.76△

2.3 各組小鼠NF-κB p50蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表3，圖1。小鼠結(jié)腸組織免疫組化染色后發(fā)現(xiàn)，空白組結(jié)腸組織表達(dá)極少量NF-κB p50蛋白，且表達(dá)位置主要位于細(xì)胞質(zhì)；模型組在腸道結(jié)構(gòu)紊亂消失的基礎(chǔ)上，與空白組比較表達(dá)明顯增多（P＜0.01），且表達(dá)位置主要位于細(xì)胞核。藥物干預(yù)后，與模型組相比，清腸溫中方高、中劑量和美沙拉嗪組均能減少NF-κB p50蛋白表達(dá)（P＜0.05），表達(dá)位置在細(xì)胞質(zhì)中為主，其中以中劑量組和美沙拉嗪組的效果最為明顯。

表3 各組小鼠NF-κB p50蛋白表達(dá)比較（平均光密度值，±s）

表3 各組小鼠NF-κB p50蛋白表達(dá)比較（平均光密度值，±s）

組 別 n空白組 15模型組 8清腸溫中方高劑量組 9 NF-κB p50 0.29±0.05 0.75±0.05*0.52±0.05△清腸溫中方中劑量組 10 0.44±0.03△清腸溫中方低劑量組 9 0.60±0.07△美沙拉嗪組 10 0.40±0.06△

圖1 各組NF-κB p50蛋白免疫組化圖（DAB染色，200倍）

3 討 論

本研究采用反復(fù)飲用DSS溶液復(fù)制慢性UC模型，其中DSS誘導(dǎo)的化學(xué)性結(jié)腸炎腸上皮損傷與人類UC的表現(xiàn)相似，其機(jī)理是溶于水后的硫酸化多糖作為一種化學(xué)毒素可以直接作用于腸上皮細(xì)胞并產(chǎn)生破壞［6］，導(dǎo)致腸腔多種抗原進(jìn)入腸黏膜，激活黏膜免疫并產(chǎn)生無(wú)法控制的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和過(guò)度的免疫應(yīng)答［7］。

人類腸道具有復(fù)雜的免疫系統(tǒng)，可以減輕消除病原體的感染，同時(shí)保持上皮細(xì)胞對(duì)食物抗原和非致病菌的耐受性［8］。腸上皮表面的黏液層中含有的大量抗菌物質(zhì)和分泌性IgA，是腸黏膜免疫的第一道防線；其次，腸上皮細(xì)胞及其分泌的抗菌肽、先天性、適應(yīng)性免疫細(xì)胞將共同起到調(diào)節(jié)黏膜免疫系統(tǒng)功能的作用。腸黏膜免疫細(xì)胞特異性的形成了腸道相關(guān)淋巴組織（GALT），細(xì)菌等抗原在GALT中激活免疫細(xì)胞從而發(fā)揮免疫效應(yīng)［9］。適應(yīng)性免疫針對(duì)不同抗原有著強(qiáng)大的特異性，T細(xì)胞在UC的發(fā)病中起著舉足輕重的作用。T細(xì)胞有多個(gè)不同的細(xì)胞亞群，可分泌不同的細(xì)胞因子并誘導(dǎo)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，其中Th1、Th2通過(guò)不同的細(xì)胞因子相互影響，維持著細(xì)胞和體液免疫功能的平衡發(fā)揮。有研究指出UC可能是Th1、Th2細(xì)胞共同作用而引起的發(fā)病［8］，因此恢復(fù)Th1/Th2平衡在UC的治療中可能是作用靶點(diǎn)之一。

在接受來(lái)自上皮細(xì)胞的損傷信號(hào)后，樹(shù)突狀細(xì)胞驅(qū)使幼稚T細(xì)胞分化成Th1和Th2不同表型，并分泌關(guān)鍵細(xì)胞因子 IFN-γ、TGF-β、IL-4、IL-5 和 IL-13 等，這些不同的細(xì)胞因子負(fù)責(zé)炎癥發(fā)展、持續(xù)的組織損傷和病理改變，包括異常的黏液分泌、纖維化、組織重塑，平滑肌細(xì)胞增生和高反應(yīng)性等［9］。Th1細(xì)胞主要分泌TNF-α、IL-6等炎癥因子并發(fā)揮促炎作用，而腸黏膜組織中的NF-κB受到上游不同因素調(diào)控發(fā)生激活后入核進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，加重炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)［10］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量明顯升高，腸黏膜中NF-κB p50表達(dá)明顯增多且大多位于細(xì)胞核內(nèi)，而血清IL-4、IL-5抗炎因子含量明顯降低，說(shuō)明DSS誘導(dǎo)的慢性UC模型中，以Th1為主的免疫應(yīng)答占主導(dǎo)，Th2細(xì)胞相對(duì)處于弱勢(shì)，Th1/Th2處于失衡狀態(tài)并偏向前者。當(dāng)采用清腸溫中方或美沙拉嗪治療后，抗炎因子 IL-4、IL-5 有所升高，促炎因子 TNF-α、IL-6、IL-1β較前減少，腸黏膜中NF-κB p50表達(dá)減少，并以細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)為主，說(shuō)明清腸溫中方和美沙拉嗪可以相對(duì)提升Th2類細(xì)胞亞群，抑制相對(duì)亢進(jìn)的Th1細(xì)胞，促進(jìn)Th1/Th2平衡狀態(tài)并恢復(fù)免疫系統(tǒng)正常功能。本研究發(fā)現(xiàn)IL-4、IL-5在治療后含量明顯高于其余炎性因子，考慮與慢性UC模型有關(guān)，這也與文獻(xiàn)［11］報(bào)道UC晚期病程以Th2型免疫反應(yīng)為主的現(xiàn)象相吻合。

清腸溫中方是北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院消化科李軍祥教授總結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)而創(chuàng)，他認(rèn)為UC病位在腸，與脾胃關(guān)系密切，病機(jī)多屬脾陽(yáng)不足、濕熱夾瘀，當(dāng)以健脾溫中、清熱化瘀法則治療，已在臨床UC治療中收獲確切療效。有學(xué)者［12-14］提出Th1/Th2失衡是溫病濕熱證共同的致病機(jī)制之一，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了清熱祛濕類方藥具有不同程度改善Th1/Th2失衡的作用，本研究發(fā)現(xiàn)清腸溫中方的清熱燥濕治法也正具備調(diào)節(jié)這兩類免疫細(xì)胞亞群的功效。姚茹冰等［15］發(fā)現(xiàn)三七總皂苷可以抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血Th1分泌的IFN-γ，促進(jìn)Th2分泌IL-4從而恢復(fù)二者平衡。研究發(fā)現(xiàn)葛根芩連結(jié)腸定位片具有降低家兔血清及結(jié)腸組織Th1細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α并提高Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-13的表達(dá)，調(diào)整兩類免疫細(xì)胞亞群的作用［16］。此外，采用利濕和血湯聯(lián)合美沙拉嗪治療UC患者后，可以顯著調(diào)控多種細(xì)胞因子的表達(dá)［17］，這些都與我們研究發(fā)現(xiàn)的清腸溫中方通過(guò)恢復(fù)Th1/Th2平衡從而起到治療UC的作用一致。

對(duì)于慢性UC小鼠，清腸溫中方不僅可以降低Th1細(xì)胞增加Th2細(xì)胞，促使二者平衡的恢復(fù)，還能減少NF-κB的激活入核，起到治療疾病的作用。但Th2細(xì)胞的主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)是否會(huì)對(duì)UC后期的恢復(fù)存在影響作用，清腸溫中方能否調(diào)控以Th2為主的Th1/Th2失衡，有待進(jìn)一步的研究。

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