，，

(長沙市婦幼保健院兒科，湖南 長沙 410000)

宮內發(fā)育遲緩(Intrauterine growth restriction,IUGR)指新生兒出生體重低于同胎齡同性別平均出生體重的兩個標準差。美國每年IUGR 新生兒出生率在5%～7% 左右[1]。IUGR不僅可導致圍產(chǎn)期死亡率增加，且患兒易罹患神經(jīng)功能障礙、胰島素抵抗、腎病等疾病[2]。對于IUGR 的神經(jīng)發(fā)育障礙的原因，內分泌異常為其研究熱點[3]。磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/ 蛋白激酶B(protein kinase B，又稱AKT)信號通路是機體內最重要信號傳導通路之一，PI3K/AKT途徑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)可參與神經(jīng)元增殖、遷移、凋亡等多種生理功能的調節(jié)[4-5]。HU等[6]證實PI3K的p110δ亞基失活模型母鼠其胎兒可表現(xiàn)為IUGR，PI3K-AKT信號途徑在IUGR發(fā)病機制中起著重要作用。本實驗采用低蛋白營養(yǎng)不良法制作IUGR新生大鼠模型，以探索PI3K/AKT信號通路在IUGR神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗分組及模型的建立取健康2月齡Sprague-Dawley(SD)大鼠24 只，雌雄各半，體重250 g 左右，按照雌雄1∶1 的比例置于同一籠中交配，次日清晨檢測出陰栓者定為受孕成功。根據(jù)隨機數(shù)字表，將12只孕鼠隨機分配到正常蛋白飼料對照組(對照組)、低蛋白飼料組(IUGR組)，每組6只孕鼠。對照組母鼠自受孕后第1天開始給予21%正常蛋白飼料喂養(yǎng)，建立正常出生體重仔鼠模型，所生仔鼠納入對照組。IUGR組母鼠自孕后給予10% 低蛋白飼料喂養(yǎng)，建立IUGR仔鼠模型，所生仔鼠為IUGR模型組。兩組仔鼠出生后母鼠均給予21%正常蛋白飼料及正常飲用水喂養(yǎng)。

1.2標本留取兩組新生大鼠分別于生后24 h內及出生后1周時處死，用10% 水合氯醛(0.35 mL/0.1 kg)腹腔注射麻醉后處死。迅速斷頭，剖顱取大腦組織，分離左側腦組織，用于蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)染色。另一部分同上法開顱取腦，用于Western blot 和RT-PCR檢測。

1.3 HE染色在海馬層面(冠狀位的視交叉的前后1 mm)取材，每個動物取3 張切片，間隔取片，切片厚5 μm，經(jīng)常規(guī)脫蠟水化后，蘇木素染色5 min，鹽酸酒精分化，自來水沖洗，伊紅染色2 min。脫水、透明、封片。

1.4 Western blot 取海馬組織用RIPA 細胞裂解液研磨裂解并離心，取上清液測蛋白濃度。樣本經(jīng) SDS-PAGE電泳分離后轉移至硝酸纖維素濾膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉PBST 溶液室溫下封閉2 h后分別加入一抗(PI3K,AKT抗體均購于CST公司，美國)、二抗孵育。洗膜后加ECL 發(fā)光試劑曝光、顯色。應用β-actin 作為內參照，結果以目的蛋白與內參蛋白表達比值表示。

1.5實時定量PCR 利用Trizol 萃取液(Invitrogen 公司，美國)對出生24 h內及出生7 天的海馬RNA 組織進行分離。使用逆轉錄試劑盒(Takara 公司，日本)進行逆轉錄反應。該反應首先在37 ℃孵育60 min，然后再85 ℃ 5 s(變性、退火反應)。實時聚合酶鏈反應在以下條件下進行兩次：95 ℃30 s，然后 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40 個周期循環(huán)。β-actin作為陰性對照。使用2-ΔΔCT法計算倍數(shù)變化。

1.6統(tǒng)計學分析統(tǒng)計分析使用SPSS 17.0軟件。計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組均值的比較使用兩獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1兩組仔鼠出生體重、生后腦重的比較給予限制性蛋白飲食孕鼠所生產(chǎn)的仔鼠出生體重(IUGR組) 符合IUGR 的診斷標準(IUGR組仔鼠vs 對照組仔鼠出生體重：5.33±0.47 gvs6.85±0.62 g)(圖1A)。在出生24 h內，IUGR 組仔鼠平均腦質量較對照組仔鼠低19%左右(0.21±0.04 gvs0.27±0.06 g，P<0.05)；而在7天時，IUGR組仔鼠腦質量較對照組仔鼠低12%左右(0.64±0.09 gvs0.73±0.11g，P<0.05)(圖1B)。而在出生21天(3周)及56天(8周)時兩組無明顯區(qū)別。

圖1 兩組大鼠出生不同時間點體重及大腦質量(n=8)與宮內發(fā)育遲緩組比較，*P<0.05,**P<0.01

2.2兩組仔鼠海馬HE 染色結果比較 在出生24 h內，對照組仔鼠海馬錐體細胞層較厚，細胞密度緊密，排列整齊；IUGR 組仔鼠海馬錐體細胞層較薄，細胞間隙大，排列疏松(圖2A、B)。在出生7天時，兩組差異無顯著性(圖2C和D)。

圖2 出生24h及7天對照組及IUGR組仔鼠海馬HE染色結果 (200×) 箭頭指示錐體細胞層A：出生24h時對照組仔鼠，海馬錐體細胞層厚，細胞密度大，排列整齊；B：出生24h時IUGR組仔鼠，海馬錐體細胞層變薄，細胞間隙大，排列疏松；C，D：出生7天對照組及IUGR組仔鼠海馬HE染色結果

2.3 Western blot和RT-PCR法檢測各組大鼠海馬PI3K， AKT的表達水平在新生大鼠出生24 h內，與對照組相比較，IUGR組大腦海馬的 AKT和PI3K mRNA的表達水平明顯升高(均P<0.05)。IUGR組的 Akt和PI3K 蛋白表達水平明顯高于對照組(均P<0.05)(圖3A，C和D)。

在仔鼠出生7天時，與對照組相比較，IUGR組的 AKT的蛋白和mRNA的表達水平明顯升高(均P<0.05)。IUGR組的 PI3k 的mRNA表達水平明顯高于對照組(均P<0.05)，但蛋白表達水平在兩組間無明顯區(qū)別(圖3E和F)。

3 討 論

近年來，對于IUGR患兒的神經(jīng)發(fā)育異常越來越受到人們的關注。LAURA等[7]通過對8個月到4歲之間的3 922名IUGR患兒和29 369名的正常兒童進行隨訪發(fā)現(xiàn)，IUGR患兒的神經(jīng)發(fā)育障礙的幾率明顯增加。BELLIDO-GONZLEZ等[8]對5 720名6～8歲的兒童研究發(fā)現(xiàn)，IUGR患兒的認知能力及學習成績明顯低于正常兒童。對IUGR患兒的神經(jīng)發(fā)育異常，在頭顱影像上最直觀表現(xiàn)為IUGR患兒大腦體積及神經(jīng)細胞數(shù)量較正常兒童的減少。在豬，大鼠等動物模型中已證實IUGR模型大腦神經(jīng)細胞數(shù)量明顯減少，利用MRI三維成像等技術研究人IUGR大腦發(fā)育發(fā)現(xiàn)，IUGR患兒的大腦皮質較正常兒童減少10%左右，其中灰質減少更加明顯，海馬、丘腦及基底節(jié)等部位也明顯減少[9]。同時SAMUELSEN等[10]研究發(fā)現(xiàn) IUGR人類胎兒大腦皮質細胞總數(shù)小于正常胎兒。在本實驗中，IUGR仔鼠大腦的重量及海馬錐體細胞密度較對照組明顯減少，與上述研究結果相符。

內分泌信號通路異常參與IUGR發(fā)病的具體機制為通過控制機體內代謝產(chǎn)物或代謝狀態(tài)導致目的物質的合成發(fā)生改變，并導致機體功能改變，最終導致IUGR的產(chǎn)生[11]。目前研究表明在IUGR患兒體內胰島素抵抗(Insulin resistance，IR )是這些異常的內分泌信號通路共同的病理生理基礎[12]。在人體內許多信號通路可誘發(fā)IR，尤以胰島素作用相關的信號通路PI3K/AKT通路分子最為重要。PI3K不僅具有脂類激酶活性，而且擁有蛋白激酶的活性。PI3K 激活后可以使細胞膜上的肌醇發(fā)生磷酸化，繼而產(chǎn)生第二信使，AKT是 PI3K 信號通路主要下游分子。AKT磷酸化激活后參與多條信號轉導途徑，最終產(chǎn)生促進細胞增殖和阻止細胞凋亡發(fā)生等一系列生理功能[13]。PI3K/AKT信號途徑紊亂已經(jīng)在IUGR動物模型及臨床實驗中已被證實。動物模型已經(jīng)證實PI3K/AKT在IUGR機體肝臟及腎臟內的異常表達[14]。PI3K、AKT及其受體在腦內表達相當豐富，大腦海馬、大腦皮質及小腦內的神經(jīng)元及星形膠質細胞內均有大量表達；PI3K/AKT信號通路已被證實在正常的大腦發(fā)育及人神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著至關重要的作用，PI3K/AKT信號途徑異?？捎绊懮窠?jīng)元及膠質細胞的增殖、分化等過程[15]。在本實驗中海馬出生1天時及7天時PI3K、AKT蛋白表達明顯升高，推測其可能機制為：機體在攝入蛋白質減少時，同時也會影響葡萄糖等代謝；由于機體存在大腦保護機制，此時PI3K/AKT通路過度激活，進而促進了葡萄糖轉運蛋白2 向膜的轉運，使神經(jīng)細胞對葡萄糖的攝取增多，最終保護大腦神經(jīng)細胞受損。這同時使神經(jīng)細胞對胰島素刺激的反應能力增加，從而促進IR的發(fā)生。由于出生24 h及7天后PI3K，AKT在兩組的表達量與大腦體重、大腦形態(tài)有相對應的關系，同時基于以前研究PI3K/AKT在腦發(fā)育的作用，可以推出PI3K/AKT信號傳導途徑在IUGR患兒神經(jīng)發(fā)育過程中起著一定的作用。

圖3 PI3K及AKT在兩組大鼠海馬中的表達水平比較(n=8) 與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01A，B：出生24 h和7天兩組大鼠PI3K和AKT mRNA的表達結果；C，D：出生24 h內兩組大鼠PI3k和AKT蛋白表達；E，F(xiàn)：出生7天時兩組大鼠PI3K和AKT蛋白表達

綜上所述，本實驗證實IUGR新生大鼠大腦質量和海馬形態(tài)學情況發(fā)生了改變；同時實驗證實在出生24 h內和出生7天IUGR海馬組織中，PI3K和AKT的表達明顯上升，推測PI3k/AKT信號傳導途徑在IUGR患兒神經(jīng)發(fā)育過程中起著一定的作用。

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