傅增輝 姜巖○☆ 劉晶 秦迎輝 金艷 張廣萍

Th17細(xì)胞是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞，通過分泌IL-17等前炎癥因子，在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[1]。研究證實(shí)，Th17轉(zhuǎn)錄因子RORγt和BATF在多種自身免疫疾病中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[2]。本研究以MS患者為研究對象，通過檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC） 中 BATF、RORγtmRNA的表達(dá)水平和Th17細(xì)胞 （CD4+IL-17+）百分率，以及血清中Th17相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平，以期闡明Th17及其相關(guān)因子在MS發(fā)病中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院和齊齊哈爾市第一醫(yī)院2013年1月至2017年3月神經(jīng)內(nèi)科確診為急性發(fā)作期的復(fù)發(fā)-緩解型多發(fā)性硬化患者作為研究對象，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2010年McDonald診斷標(biāo)準(zhǔn)及 《多發(fā)性硬化診斷和治療中國專家共識(2014版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[3-4]，且為緩解-復(fù)發(fā)型多發(fā)性硬化急性發(fā)作期，且出現(xiàn)神經(jīng)功能惡化、發(fā)作出現(xiàn)在2周以內(nèi)；②治療后癥狀明顯減輕，EDSS減少＞1分。排除標(biāo)準(zhǔn)：①假性復(fù)發(fā)；②入院前3個(gè)月內(nèi)接受免疫調(diào)節(jié)治療的患者 （包括激素、環(huán)磷酞胺等免疫抑制劑或重組人干擾素治療）；③合并其他免疫相關(guān)疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、腫瘤等患者；④合并顱內(nèi)外感染，如腦炎、腦膜炎等患者；⑤卒中患者。選取本院體檢中心與病例組在性別、年齡相匹配的健康人為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集 收集研究對象吸煙史、飲酒史、高血壓史和冠心病史等。病例組急性發(fā)作期MS入院后均給予甲基潑尼松龍1000 mg/d，3 d后減至500 mg，每3 d減一半減至40 mg時(shí)改為口服，每周減4 mg至減完，及營養(yǎng)神經(jīng)（如甲鈷胺、維生素B1）和對癥治療等。

1.3 標(biāo)本采集 所有研究對象均于清晨空腹采肘靜脈血10 mL（肝素鈉抗凝），室溫靜置30 min后，4℃、1500 r/min離心10 min，取血清，置于-70℃保存，用于后續(xù)細(xì)胞因子的檢測。Ficoll密度梯度離心后分離PBMC，用于后續(xù)提取RNA及流式細(xì)胞術(shù)檢測百分率。

1.4 ELISA 法檢測血清中IL-10、IL-17和IL-27表達(dá)水平 嚴(yán)格按照ELISA試劑盒 （德國Qiagen公司生產(chǎn)）說明書操作，檢測血清中IL-10、IL-17和IL-27表達(dá)水平。每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)2個(gè)復(fù)孔，測定各孔在492 nm處的吸光度（A）值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品濃度，IL-10、IL-17和IL-27表達(dá)水平均以ng/L為單位表示。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)RNA表達(dá)水平采用Trizol法提取PBMC中總RNA，使用Prime-Script TM RT Reagent Kit試劑盒 （大連寶生公司生產(chǎn)）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBROR Premix Ex Taq TM試劑盒進(jìn)行RT-PCR（上海生工公司生產(chǎn)），嚴(yán)格執(zhí)行說明書操作，檢測 RORγt和 BATF mRNA表達(dá)水平。記錄反應(yīng)后的CT值，采用2-ΔΔCT法計(jì)算mRNA表達(dá)水平。所需引物見表1。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血PBMC中Th17細(xì)胞百分率 取PBMC懸液加入6孔板中，加入前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基（PMA）（20 μg/L），于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h（37℃、5%CO2）。收集細(xì)胞分為同型對照管和試驗(yàn)管，加入PE-cy5抗人CD4+mAB（上海生工公司生產(chǎn)）后避光孵育30 min，棄上清，多聚甲醛固定，用皂素穿膜。試驗(yàn)管加入PE抗人IL-17mAB（上海生工公司生產(chǎn)），同型對照組加入同型對照抗體，避光孵育1 h，洗滌液重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測。以CD4直條圖設(shè)門區(qū)分出CD4+細(xì)胞，以散點(diǎn)圖表示IL-17+細(xì)胞，用Cellquest軟件獲取并分析數(shù)據(jù)，計(jì)算Th17細(xì)胞百分率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量資料采用±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，定性數(shù)據(jù)用率表示，組間比較采用 χ2檢驗(yàn)。 檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 病例組女39例，男14例；年齡23～51 歲，平均為（36.19±11.37）歲；病程 1.0～11.5 年，平均（4.34±5.17）年；EDSS 評分 1～7.01 分，平均（3.67±2.39）分。 對照組 53例，女 39例，男 14例，年齡 24～51 歲，平均為（36.57±11.07）歲。 兩組間一般資料進(jìn)行比較，差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（見表 2）。

表1 所需引物序列

表2 病例組與健康對照組一般資料

2.2相關(guān)細(xì)胞因子及Th17細(xì)胞百分率 與健康對照組比較，MS患者治療前血漿IL-17水平較高，而IL-10、IL-27水平均較低，外周血 PBMC中BATF和RORγt mRNA表達(dá)水平均升高，Th17細(xì)胞 （CD4+IL-17+細(xì)胞）百分率明顯升高 （均P＜0.05）；與治療前比較，MS患者治療4周后血漿IL-17水平降低，相反IL-10、IL-27水平均升高，BATF和RORγt mRNA表達(dá)水平均降低，Th17細(xì)胞 （CD4+IL-17+細(xì)胞）百分率明顯降低 （均P＜0.05）；治療后與健康對照組比較，IL-10與IL-17仍偏高 （均P＜0.05）， 而 IL-27 偏低 （P＜0.05），BATF和RORγt mRNA表達(dá)水平均升高，Th17細(xì)胞（CD4+IL-17+細(xì)胞）百分率明顯升高（均P＜0.05）（見表 3）。

3 討論

多發(fā)性硬化是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘性疾病，是一種自身免疫性疾病，中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘病變?yōu)槠渲饕±硖攸c(diǎn)，病灶的空間多發(fā)性和時(shí)間多發(fā)性為其主要臨床特點(diǎn)[5]。目前MS的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，但已有研究證實(shí)，在MS的發(fā)病和病情進(jìn)展中CD4+T細(xì)胞起著重要的介導(dǎo)作用[6]。

Th17細(xì)胞是近年來新發(fā)現(xiàn)的一群效應(yīng)性CD4+T 細(xì)胞，主要分泌 IL-17A（即 IL-17）、IL-17F、IL-22和TNF-α等前炎癥因子發(fā)揮促炎作用[6]。目前發(fā)現(xiàn)MS發(fā)病機(jī)制主要由Th1、Th17細(xì)胞參與致病，同時(shí)調(diào)節(jié)T細(xì)胞、APC等細(xì)胞通過細(xì)胞因子參與致病[7]。細(xì)胞因子異常在自身免疫疾病中起到重要作用。IL-17、IL-27分別主要由Th17、APC細(xì)胞分泌，研究發(fā)現(xiàn)，在MS發(fā)病中IL-17具有促炎作用，而IL-10和IL-27具有廣泛抑制作用，尤其IL-27對Th1、Th17細(xì)胞具有明顯抑制作用[8]。IL-10主要通過抑制抗原呈遞細(xì)胞向CD4+Th1遞呈抗原，使CD4+Th1增殖受阻，從而發(fā)揮其免疫抑制作用[9]。在本研究中病例組治療前較對照組IL-17水平較高，而IL-10、IL-27水平均較低，Th17細(xì)胞百分率較高，經(jīng)治療后IL-17及Th17細(xì)胞百分率水平回落，相反IL-10、IL-27水平均升高，與既往研究相同。病例組治療后與對照組對比，除IL-10外均有明顯差異，而IL-10水平與健康組無顯著差異。SOLDAN等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在MS患者體內(nèi)IL-10分泌與表達(dá)呈持續(xù)性降低，提示IL-10是一種免疫抑制因子，有助于MS患者減輕疾病癥狀?？紤]IL-10與MS的病情加重有關(guān)，病情緩解而IL-10水平恢復(fù)。

表3 各組研究對象血清中IL-10、IL-17、IL-27和PBMC中BATF、RORγt mRNA相對表達(dá)水平及Th17細(xì)胞百分率

RORγt是誘導(dǎo)Th17細(xì)胞產(chǎn)生及分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化成Th17細(xì)胞，作用類似于T-bet對Th1，或者GATA3對Th2細(xì)胞的作用，是Thl7細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。RORγt過表達(dá)促進(jìn)Th17的分化及IL-17的分泌，而RORγt缺失則Th17分化量及IL-17的濃度顯著下降[11]。BATE是堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1(AP-1)超家族中的一員，僅有DNA結(jié)合區(qū)而缺乏轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，被認(rèn)為是活化蛋白-1家族的負(fù)調(diào)控因子。研究證實(shí)，BATF缺陷小鼠Th17細(xì)胞分化受阻，對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)完全抵抗[12]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的BATF-/-CD4+和CD8+T細(xì)胞，不能產(chǎn)生Th17分化所需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RORγt，即使引入大量過表達(dá)的RORγt也不能完全恢復(fù)IL-17的表達(dá)[13-14]。MAR TINET等[15]研究不僅表明BATE對Th17細(xì)胞分化具有正向調(diào)節(jié)作用，還進(jìn)一步提示這種調(diào)節(jié)機(jī)制與BATF通過結(jié)合IL-17基因啟動(dòng)子及增強(qiáng)Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)有關(guān)。在本研究中，病例組治療前 IL-17、BATF、RORγt和 Th17 細(xì)胞均呈現(xiàn)高水平，而治療后IL-17、BATF、RORγt和Th17細(xì)胞均降低，考慮其均與MS發(fā)病相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)BATF、RORγt可能通過共同調(diào)控Th17的分化，從而促進(jìn)Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-17的高表達(dá)，間接活化和募集中性趨化因子IL-10和IL-27，促使MS的發(fā)生與進(jìn)展，其作用的確切機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究；而檢測轉(zhuǎn)錄因子RORγt和BATF及其相關(guān)細(xì)胞因子可能對MS的診斷及預(yù)后判斷具有一定的臨床意義，也為MS的個(gè)性化治療提供了潛在的新靶標(biāo)。在后續(xù)研究中，將進(jìn)行更大樣本，更深入地研究，推動(dòng)其在臨床中的應(yīng)用。

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