袁星星，余元善，吳繼軍，肖更生，徐玉娟,*，鄒 波

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045）

荔枝（Litchi chinensis），屬無(wú)患子科荔枝屬植物，原產(chǎn)于中國(guó)南部，一直以來(lái)，中國(guó)都是世界上最大的荔枝生產(chǎn)地，由于荔枝適宜生長(zhǎng)在熱帶及亞熱帶地區(qū)，因此荔枝主要種植于我國(guó)廣東、廣西、福建、臺(tái)灣等地，其中廣東是中國(guó)荔枝分布最多的省，據(jù)2016年廣東統(tǒng)計(jì)年鑒[1]，近6年來(lái)廣東荔枝產(chǎn)量均處于上升趨勢(shì)，僅2015年總產(chǎn)量高達(dá)128.05萬(wàn) t。

大量研究表明，荔枝果實(shí)中富含糖分、有機(jī)酸、膳食纖維、維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并含有豐富的多酚和花色苷等生物活性物質(zhì)[2]。由于荔枝成熟期集中且不耐貯藏，故荔枝主要以鮮食為主，據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年有20%以上的荔枝因腐爛變質(zhì)造成損失[3]，因此荔枝深加工在荔枝產(chǎn)業(yè)中越來(lái)越受重視。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于荔枝的研究主要集中在荔枝活性成分分離鑒定[4]、荔枝褐變[5-7]、荔枝風(fēng)味[3,8-9]等方面，而對(duì)荔枝汁體系不穩(wěn)定現(xiàn)象尚未進(jìn)行深入探討。陳奇[10]、劉爽[11]、陳雪[12]等研究表明酸性蛋白飲料有凝聚沉淀的傾向，原因可能是該酸性蛋白飲料的pH值接近蛋白等電點(diǎn)，導(dǎo)致蛋白沉淀，致使飲料不穩(wěn)定現(xiàn)象發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)荔枝汁果肉沉淀物的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)荔枝汁果肉沉淀物中蛋白質(zhì)含量非常高，約占干質(zhì)量的23%。利用Osborne分級(jí)法對(duì)荔枝蛋白的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白的含量組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)谷蛋白所占比例最高，超過(guò)72%，因此荔枝蛋白主要為谷蛋白，而谷蛋白水溶性較差，一般溶于稀堿溶液，可初步推斷谷蛋白是導(dǎo)致荔枝汁不穩(wěn)定的重要因素之一[13]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于谷蛋白的研究主要集中在小麥[14-16]、米糠[17-18]等農(nóng)作物中，分別研究了小麥谷蛋白結(jié)構(gòu)對(duì)面團(tuán)特性的影響，米糠谷蛋白結(jié)構(gòu)及其功能特性。劉麗等[16]指出，高分子麥谷蛋白亞基與低分子麥谷蛋白亞基通過(guò)分子間二硫鍵形成麥谷蛋白聚合體，影響面團(tuán)流變學(xué)特性。關(guān)于荔枝谷蛋白結(jié)構(gòu)及其功能特性的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究擬以荔枝谷蛋白為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析、熱穩(wěn)定性和紅外光譜分析，并測(cè)定其表面疏水性、巰基和二硫鍵含量，旨在對(duì)荔枝谷蛋白的結(jié)構(gòu)及特性作探討，為荔枝飲料穩(wěn)定性的進(jìn)一步研究提供參考，同時(shí)也促進(jìn)了荔枝果渣中蛋白質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試?yán)笾χ瓰闊岚褪蠚⒕笾χɑ粗Γ?，由果香園食品有限公司提供。

SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；三羥甲基氨基甲烷（Tris） 美國(guó)MYM生物科技有限公司；甘氨酸（glycine，Gly）、SDS、5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CR22GIII高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳儀、Universal HoodII凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司；PB-10型pH計(jì) 德國(guó)Sartorius公司；UV-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；DHG-9240型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)有限公司；Kjeltec TM8400自動(dòng)凱氏定氮儀瑞典福斯儀器公司；DSC200F3差示掃描量熱儀 德國(guó)耐馳公司；Magna 760紅外光譜儀 美國(guó)Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 荔枝汁谷蛋白的制備

參考Horax等[19]提取荔枝汁沉淀物中不同類型蛋白質(zhì)（按溶解特性分）的方法，略作改動(dòng)。稱取10 g荔枝汁沉淀，分別以1∶10（g/mL）加入蒸餾水、1 mol/L的NaCl溶液、體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液和0.1 mol/L的NaOH溶液提取荔枝汁清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，4 ℃、10 000 r/min離心25 min，收集谷蛋白上清液，用1 mol/L的HCl溶液調(diào)pH值至等電點(diǎn)，4 ℃、10 000 r/min離心25 min，沉淀再以1∶10（g/mL）加蒸餾水洗滌3 次，收集沉淀，沉淀冷凍干燥后即為荔枝汁谷蛋白樣品，用于指標(biāo)分析。所制得的樣品經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，按換算系數(shù)為6.25計(jì)算，其蛋白質(zhì)含量為（74.89±0.56）%。

1.3.2 荔枝汁谷蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取等量的荔枝汁谷蛋白溶液，用0.02 mol/L的HCl溶液分別調(diào)至不同的pH值（1.0、2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0），4 ℃、10 000 r/min離心25 min，傾去上清液，將離心管倒扣5 min，稱量離心管沉淀物質(zhì)量。離心沉淀率計(jì)算公式如下[13]：

式中：SR為離心沉淀率；m2為離心后沉淀物的質(zhì)量/g；m1為離心前溶液的質(zhì)量/g。

1.3.3 SDS-PAGE分析

1.3.3.1 樣品處理

稱取1 g荔枝樣品，以1∶10加入蒸餾水洗3 次，加0.25 g交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，再加5 mL蛋白質(zhì)裂解液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲），還原電泳中蛋白質(zhì)裂解液含有40 mmol/L二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT），用1 mol/L的HCl和NaOH溶液調(diào)pH值至6.8，4 ℃、12 000 r/min離心25 min，上清液用于SDS-PAGE分析。

1.3.3.2 SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)步驟

參考黎衛(wèi)等[20]的方法，略作改動(dòng)。蛋白樣品加入上樣緩沖液后，沸水浴5 min，冷卻后上樣5 μL，采用5 g/100 mL濃縮膠和10 g/100 mL分離膠進(jìn)行垂直電泳，預(yù)電泳和濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為100 V，待溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距離分離膠下邊緣1 cm左右時(shí)關(guān)閉電源，結(jié)束電泳，染色及脫色步驟均參照SDS-PAGE快速配制試劑盒說(shuō)明書(shū)，脫色后拍照保存。

1.3.4 表面疏水性的測(cè)定

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考王洪偉等[21]的方法，略作改動(dòng)。取已知濃度的SDS溶液（0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mmol/L）1 mL，加入20 mL氯仿，混合均勻后加入5 mL亞甲基藍(lán)溶液（0.24 g/L），充分混合均勻，2 500 r/min離心15 min，取底層SDS與亞甲基藍(lán)的混合物，于655 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。其蛋白質(zhì)的表面疏水性用1 mg蛋白質(zhì)結(jié)合SDS含量（μg/mg）表示。吸光度（y）與SDS濃度（x）的回歸方程為y=4.74x+0.006 8（R2=0.999 2）。

1.3.4.2 表面疏水性的測(cè)定

參考王洪偉等[21]的方法，略作改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取10 mg蛋白質(zhì)樣品溶解于40 mL SDS溶液（0.1 mmol/L），充分?jǐn)嚢? h，5 000 r/min離心10 min，上清液在蒸餾水中透析36 h后，取1 mL透析液與20 mL氯仿混合均勻，然后在氯仿層中加入5 mL 0.24 g/L亞甲基藍(lán)溶液，充分混合均勻，2 500 r/min離心15 min，取底層SDS與亞甲基藍(lán)的混合物，于655 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。蛋白質(zhì)表面疏水性的計(jì)算公式如下：

1.3.5 巰基和二硫鍵含量的測(cè)定

分別稱取0.05 g蛋白質(zhì)樣品于4 mL Tris-Gly 8 mol/L尿素溶液（pH 8.0），充分?jǐn)嚢? h，10 000 r/min離心10 min，取上清液作為蛋白液樣品，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液的蛋白質(zhì)含量。

1.3.5.1 游離巰基含量的測(cè)定

參考Hakimia等[22]的方法，略作改動(dòng)。準(zhǔn)確量取1.0 mL蛋白液樣品，加入5.0 mL Tris-Gly 8 mol/L尿素溶液（pH 8.0）和0.04 mL DTNB溶液（4 mg/mL），迅速混合后于25 ℃保溫反應(yīng)25 min，然后在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。游離巰基含量按下式計(jì)算：

式中：73.53為106/（1.36×104），1.36×104為Ellman試劑的摩爾消光系數(shù)/（L/（mol·cm））；A412nm為波長(zhǎng)412 nm處所測(cè)得的吸光度；ρ為蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；D為稀釋因子，對(duì)游離巰基測(cè)定中的D值取6.04。

1.3.5.2 總巰基含量的測(cè)定

準(zhǔn)確量取0.6 m L的蛋白液樣品，然后加入3.0 mL Tris-Gly 8 mol/L尿素溶液（含40 mmol/L DTT，pH 8.0），混合均勻后于25 ℃保溫反應(yīng)1 h，再加入6 mL 12% TCA，混合均勻后繼續(xù)保溫反應(yīng)1 h，5 000 r/min離心10 min，沉淀物繼續(xù)用12% TCA溶液洗滌，重復(fù)4 次，沉淀加入9.0 mL Tris-Gly 8 mol/L尿素溶液（pH 8.0），然后加入0.09 mL DTNB溶液（4 mg/mL），混勻后于25 ℃保溫反應(yīng)25 min，然后在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度?？値€基含量按下式計(jì)算：

式中：D為稀釋因子，對(duì)總巰基含量測(cè)定中的D值取16.15。

1.3.5.3 二硫鍵含量的計(jì)算

1.3.6 熱穩(wěn)定性的測(cè)定

精確稱取蛋白質(zhì)樣品（5 mg左右）并記錄質(zhì)量，將蛋白質(zhì)均勻地鋪在鋁制坩堝中壓片，然后置于差示掃描量熱儀中進(jìn)行升溫掃描。以空鋁盒為空白對(duì)照，掃描溫度范圍為25～150 ℃，升溫速率為10 ℃/min，氮?dú)饬魉贋?0.0 mL/min。

1.3.7 紅外光譜分析

稱取一定量的蛋白質(zhì)樣品與溴化鉀混合（質(zhì)量比1∶100），用研缽研磨成均勻粉末，壓制成薄片，然后于紅外光譜儀中作全波長(zhǎng)（400～4 000 cm-1）掃描。利用PeakFit v4.12軟件對(duì)酰胺I帶區(qū)域（1 600～1 700 cm-1）圖譜進(jìn)行分析。先基線校正，然后用Gaussian去卷積，再由二階導(dǎo)數(shù)擬合，確定各個(gè)子峰與各二級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，然后根據(jù)各子峰所占面積計(jì)算出各部分二級(jí)結(jié)構(gòu)所占的比例。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0和Origin 8.5軟件進(jìn)行相關(guān)性和線性回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 荔枝沉淀谷蛋白等電點(diǎn)

蛋白質(zhì)由氨基酸組成，其分子表面帶有很多可解離基團(tuán)，如谷氨酸、天冬氨酸殘基中的γ值和β-羧基，賴氨酸殘基中的ε-氨基，精氨酸殘基中的胍基和組氨酸的咪唑基，此外，在肽鏈兩端還有游離的α-氨基和α-羧基，因此，蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)[23]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，其游離的正、負(fù)離子相等，凈電荷為零，此時(shí)蛋白質(zhì)沉淀率最大。由圖1可知，在pH值為3.5處，谷蛋白沉淀率達(dá)到最大值14%，根據(jù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)處溶解度最低原理，因此荔枝谷蛋白等電點(diǎn)pI值為3.5左右。張敏等[18]和王艷玲[24]按照Osbron法提取米糠中4 種蛋白質(zhì)，采用福林-酚法測(cè)定4 種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，其中谷蛋白的等電點(diǎn)為4.6；郭榮榮等[25]根據(jù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)電導(dǎo)率最低的原理分別測(cè)定各蛋白液的等電點(diǎn)，其中谷蛋白的等電點(diǎn)也為4.6左右；李小華等[26]采用雙縮脲法測(cè)定山毛豆種子4 種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)谷蛋白等電點(diǎn)為3.5～3.8。在pH 4.0左右，荔枝谷蛋白沉淀率較高，當(dāng)pH值大于5.0時(shí)沉淀率顯著降低，因此谷蛋白溶于稀堿溶液。酸性荔枝飲料pH值在4.0左右，因此這也是酸性荔枝飲料穩(wěn)定性差的重要原因之一。

圖1 pH值對(duì)荔枝汁谷蛋白沉淀的影響Fig.1 Effect of pH values on glutelin precipitation in litchi juice

2.2 荔枝谷蛋白SDS-PAGE分析

對(duì)荔枝谷蛋白組分進(jìn)行SDS-PAGE分析，判斷荔枝谷蛋白組分分子質(zhì)量大小。以Marker中各蛋白遷移率（即比移值，樣品點(diǎn)中心處與點(diǎn)樣處的距離除以展開(kāi)劑前沿與點(diǎn)樣處的垂直距離）為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)進(jìn)行作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=-1.039 6x+5.189 4，R2=0.984 8。

由圖2可知，非還原態(tài)條帶明顯比還原態(tài)條帶少，且非還原態(tài)中，117 kDa以上的條帶有3 條，而還原態(tài)只有1 條，非還原態(tài)中，分子質(zhì)量較小的亞基條帶明顯比還原態(tài)少，但不管是非還原態(tài)還是還原態(tài)，谷蛋白亞基分子質(zhì)量大部分處于30～90 kDa，主要集中在50 kDa左右。非還原狀態(tài)下，荔枝谷蛋白約有10 個(gè)條帶，還原態(tài)下約有12 個(gè)條帶，說(shuō)明荔枝谷蛋白組分復(fù)雜且含有二硫鍵，經(jīng)DTT還原后，某些大分子條帶消失，出現(xiàn)新的小分子條帶。通過(guò)對(duì)比荔枝谷蛋白還原態(tài)和非還原態(tài)，可知其亞基分子質(zhì)量大部分都大于50 kDa，說(shuō)明荔枝谷蛋白分子較大，更易于沉淀，可能是導(dǎo)致荔枝汁體系不穩(wěn)定的原因之一。Wang Zengxuan等[27]研究指出，米糠谷蛋白分子是由多肽鏈彼此通過(guò)二硫鍵及疏水作用連接而成，形成大分子蛋白質(zhì)聚合體，導(dǎo)致其溶解性較低，限制了米糠谷蛋白在液態(tài)食品及飲料中的應(yīng)用。

圖2 荔枝汁谷蛋白的SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE prof i le of glutelin in litchi juice

2.3 谷蛋白的表面疏水性

SDS是一種蛋白質(zhì)變性劑，然而在極低濃度下，SDS還不足以使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，但其能與蛋白質(zhì)疏水鍵相互作用結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，經(jīng)透析后用氯仿將未結(jié)合的SDS提取出來(lái)并與亞甲基藍(lán)結(jié)合，通過(guò)測(cè)定SDS-亞甲基藍(lán)吸光度的不同反映蛋白質(zhì)表面疏水性基團(tuán)的多少。本研究運(yùn)用SDS法測(cè)定荔枝谷蛋白表面疏水性，根據(jù)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得知荔枝谷蛋白表面疏水性為（74.25±5.26）μg/mg（1 mg的荔枝谷蛋白樣品結(jié)合74.25 μg SDS）。對(duì)比耿瑋蔚等[28]運(yùn)用同樣的方法測(cè)定大豆分離蛋白表面疏水性可知，荔枝谷蛋白表面疏水性與經(jīng)2 g/100 mL SDS溶液處理后的表面疏水性相當(dāng)，因?yàn)殡S著SDS質(zhì)量濃度提高，大豆分離蛋白表面疏水性也有不同程度的提高，因此可推斷荔枝谷蛋白表面疏水性大于大豆分離蛋白表面疏水性。王中江等[29]研究表明大豆分離蛋白的表面疏水性在等電點(diǎn)附近出現(xiàn)最大值，其表面疏水性與溶解度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。荔枝汁pH值約為4.5，處于荔枝谷蛋白等電點(diǎn)附近，因此荔枝汁出現(xiàn)不穩(wěn)定現(xiàn)象。

2.4 谷蛋白的巰基和二硫鍵分析

蛋白質(zhì)是由氨基酸聚合而成的生物大分子物質(zhì)，二硫鍵等基團(tuán)間的相互作用為蛋白質(zhì)產(chǎn)生維持高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能提供基礎(chǔ)，其中半胱氨酸殘基中的巰基是所有蛋白質(zhì)氨基酸殘基中最活潑的基團(tuán)，在體內(nèi)參與抗氧化、亞硝基化和巰基-二硫鍵交換等多種重要生理反應(yīng)[30]。二硫鍵由半胱氨酸殘基的兩個(gè)硫醇基氧化而成，在蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性方面扮演著重要角色[31]。本研究采用Ellman’s試劑比色法測(cè)定荔枝谷蛋白的巰基和二硫鍵，其中游離巰基含量為（29.83±1.72）μmol/g，總巰基含量為（40.59±2.04）μmol/g，二硫鍵含量為（5.38±0.18）μmol/g?？梢?jiàn)荔枝汁谷蛋白主要含有游離巰基，其二硫鍵含量較少，結(jié)合圖2，對(duì)比還原前和還原后的荔枝谷蛋白分子質(zhì)量，可知經(jīng)DTT還原后，只有小部分大分子質(zhì)量的條帶消失，說(shuō)明經(jīng)DTT還原的二硫鍵較少，與該結(jié)果相符。由于在不同環(huán)境下，二硫鍵和游離巰基會(huì)發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，如半胱氨酸在堿性溶液中易被氧化形成二硫鍵，生成胱氨酸[30]，因此氨基酸組成及排列在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能中也扮演著重要角色。

2.5 谷蛋白的熱穩(wěn)定性分析

差示掃描量熱法是一種熱分析法，在程序控制溫度下，測(cè)量輸入到試樣和參比物的功率差（如以熱的形式）與溫度的關(guān)系。本研究采用差示掃描量熱分析荔枝谷蛋白熱穩(wěn)定性，由圖3可知，荔枝谷蛋白的變性溫度為105.24℃，均比王洪偉等[21]研究的麥谷蛋白（66.81 ℃）和青稞谷蛋白（71.28 ℃）以及Adebiyi等[32]研究的米糠谷蛋白（75.4±0.2）℃變性溫度高。對(duì)于蛋白質(zhì)，熱處理（差示掃描量熱檢測(cè)）是一個(gè)變性或蛋白質(zhì)展開(kāi)的過(guò)程[19]，變性溫度越大，熱穩(wěn)定性越好，說(shuō)明荔枝谷蛋白的熱穩(wěn)定性比麥谷蛋白、青稞谷蛋白、米糠谷蛋白好，荔枝汁飲料在熱殺菌過(guò)程中可以保持較好的穩(wěn)定性。黎衛(wèi)等[33]研究不同pH值（5.0、7.0、9.0）對(duì)芡實(shí)谷蛋白熱變性的影響，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)在pH 5.0時(shí)谷蛋白變性溫度最高，原因可能是谷蛋白等電點(diǎn)在pH 5.0附近，蛋白質(zhì)所帶凈電荷少，凈靜電排斥能量小于其他穩(wěn)定谷蛋白質(zhì)的相互作用的能量，谷蛋白較穩(wěn)定，從而其變性溫度較高[34]。本研究的谷蛋白樣品也是在等電點(diǎn)處制備，有可能導(dǎo)致其變性溫度較高。

圖3 荔枝汁谷蛋白的差示掃描量熱曲線Fig.3 DSC curve of glutelin in litchi juice

2.6 谷蛋白的紅外光譜分析

蛋白質(zhì)在中紅外區(qū)（4 000～400 cm-1）有若干特征吸收峰，其中酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）對(duì)于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)最有研究?jī)r(jià)值[35]。酰胺I帶一般能反映蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其主要與C＝O的伸縮振動(dòng)有關(guān)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的氨基酸殘基間形成的氫鍵較強(qiáng)時(shí)，C＝O的電子云密度較低，僅需提供較少的能量就可以使其振動(dòng)，C＝O的吸收峰向低波數(shù)方向移動(dòng)，接近1 600 cm-1，基于此原理，運(yùn)用紅外光譜分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，其對(duì)應(yīng)關(guān)系如下：β-折疊（1 610～1 640 cm-1）、無(wú)規(guī)則卷曲（1 640～1 650 cm-1）、α-螺旋（1 650～1 660 cm-1）和β-轉(zhuǎn)角（1 660～1 700 cm-1）[21]。

圖4 荔枝汁谷蛋白的紅外光譜圖Fig.4 IR spectrum of glutelin in litchi juice

由圖4可知，樣品酰胺I帶有很強(qiáng)的吸收峰，說(shuō)明樣品蛋白質(zhì)含量非常高。運(yùn)用PeakFit v4.12軟件對(duì)紅外光譜圖酰胺I帶進(jìn)行分析，得知荔枝谷蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由β-折疊和β-轉(zhuǎn)角為主，其中β-折疊占33.92%，β-轉(zhuǎn)角占64.7%，少數(shù)為無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。β-折疊是一種具有特定幾何形狀的伸展結(jié)構(gòu)，主要與局部的協(xié)同性氫鍵形成有關(guān)，它也是一種重復(fù)性的結(jié)構(gòu)而且在β-折疊中肽主鏈都處于最伸展的構(gòu)象，其通常較α-螺旋結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，一般β-折疊含量高的蛋白質(zhì)具有較高的變性溫度。β-轉(zhuǎn)角則不同，它是一種非重復(fù)性結(jié)構(gòu)，主要與多肽鏈的彎曲、回折和重新定向有關(guān)，β-轉(zhuǎn)角大多處在蛋白質(zhì)分子的表面，因?yàn)樵谶@里改變多肽鏈方向的阻力比較小，β-轉(zhuǎn)角的存在更有利于蛋白質(zhì)生成結(jié)實(shí)、球狀的結(jié)構(gòu)[36]。目前，由于對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與其宏觀功能性質(zhì)關(guān)系的研究尚存不足，并且蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)本身就很復(fù)雜，加上測(cè)定時(shí)較多的影響因素及酰胺I帶各子峰的準(zhǔn)確歸屬上存有的一些爭(zhēng)議[37]，因此僅靠紅外光譜完全解釋二級(jí)結(jié)構(gòu)與宏觀功能性的關(guān)系仍有很大難度。

3 結(jié) 論

本課題組采用Osborne分級(jí)法提取荔枝蛋白并用凱氏定氮法進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)谷蛋白所占比例最高，超過(guò)72%。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究荔枝谷蛋白的結(jié)構(gòu)及特性，發(fā)現(xiàn)荔枝谷蛋白分子質(zhì)量較大，主要集中在50 kDa左右，非還原狀態(tài)下主要有10 個(gè)條帶，成分復(fù)雜，經(jīng)還原后，少量大分子條帶消失，小分子條帶增加；谷蛋白等電點(diǎn)pI值為3.5左右；用蛋白樣品結(jié)合SDS的能力表征蛋白質(zhì)的表面疏水特性，得出1 mg的荔枝谷蛋白樣品結(jié)合（74.25±5.26）μg SDS；游離巰基含量為（29.83±1.72）μmol/g，總巰基含量為（40.59±2.04）μmol/g，二硫鍵含量為（5.38±0.18）μmol/g；變性溫度為105.24 ℃。荔枝汁體系偏酸，谷蛋白分子質(zhì)量較大，且谷蛋白在pH 3～5時(shí)溶解性較差，故在制作酸性荔枝飲料時(shí)體系不穩(wěn)定。研究表明，荔枝谷蛋白表面疏水性較大，二硫鍵較少，而其變性溫度高達(dá)105.24 ℃，比其他植物蛋白變性溫度（通常低于100 ℃）高[19]，Kudre等[38]認(rèn)為熱穩(wěn)定性取決于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及相關(guān)結(jié)合力，且一般β-折疊含量高的蛋白質(zhì)具有較高的變性溫度。本研究采用紅外光譜對(duì)荔枝汁谷蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，得出β-折疊和β-轉(zhuǎn)角為其主要結(jié)構(gòu)，分別占33.92%和64.7%，可知荔枝谷蛋白β-折疊結(jié)構(gòu)所占比例較低，但谷蛋白變性溫度高達(dá)105.24 ℃，說(shuō)明僅僅通過(guò)紅外光譜解釋蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與其宏觀功能性的關(guān)系仍有較大難度。

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