李靖，閆明明

(1.洛陽職業(yè)技術(shù)學院藥檢系，河南 洛陽 471002；2. 河南科技大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 洛陽 471002)

伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma, BL)，屬于B淋巴細胞性的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，常發(fā)于兒童和青少年，很少在中年人群中發(fā)現(xiàn)[1]。70%～80%高速增殖的伯基特淋巴瘤發(fā)生染色體易位[2]，染色體易位導致致癌基因和c-Myc基因過表達以及組成性激活，導致細胞形狀轉(zhuǎn)化，細胞增殖失控[3]。目前，伯基特淋巴瘤化療包括環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿、阿糖胞苷和利妥昔單抗針對性治療，雖然在兒童患者中取得了一定的治療效果，然而對青少年患者來說依然存在預(yù)后較差現(xiàn)象[4-5]。因此需要有更有效的化療藥物提高伯基特淋巴瘤的治療效果。

異常NF-κB激活以及促增殖以及抗凋亡基因的高表達，是多種惡性淋巴瘤主要特征之一，如霍奇金淋巴瘤[6]、彌漫性大B細胞淋巴瘤[7]和伯基特淋巴瘤[8]。有研究證實，NF-κB參與調(diào)控B、T淋巴瘤細胞增殖基因cyclin D1、c-Myc和抗凋亡基因(Bcl-2, Bcl-xL)激活，且與淋巴細胞發(fā)生、發(fā)展和增殖相關(guān)[9]。而c-Myc可以通過NF-κB信號途徑抑制免疫系統(tǒng)導致伯基特淋巴瘤免疫缺陷[10]。這些研究暗示以NF-κB為靶標的藥物可能用于治療伯基特淋巴瘤。

硼替佐米(bortezomib，BZ)是FDA第一個批準的蛋白酶體抑制劑，可以通過抑制IκBα降解，進而抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活和轉(zhuǎn)位，可以用于套細胞淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的治療[11-12]。然而硼替佐米治療伯基特淋巴瘤的作用和機制尚未完全明了。因此，筆者從2016年6—12月研究硼替佐米對人伯基特淋巴瘤細胞株Raji細胞凋亡的影響及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑人伯基特淋巴瘤細胞株Raji細胞購自美國標準菌庫(American Type Culture Collection，ATCC)；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Sigma公司；胎牛血清(FBS)購自美國Invitrogen公司；硼替佐米購自美國Milennium公司，用無菌生理鹽水配置成1 mmol·L-1母液備用；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基公司；NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase 3、cleaved-caspase 3和GAPDH抗體均購自美國Santa Cruze公司，抗兔和抗鼠二抗購自江蘇碧云天生物研究所。

1.2細胞培養(yǎng)人伯基特淋巴瘤細胞株Raji細胞培養(yǎng)于37 ℃、含有5%二氧化碳(CO2)飽和濕度培養(yǎng)箱中，其培養(yǎng)基是含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，并且向培養(yǎng)基加入青霉素-鏈霉素雙抗，每3天換液一次。

1.3MTT實驗將對數(shù)期Raji細胞以每毫升1×104個的密度接種于96孔板中，設(shè)置空白對照孔，細胞分為兩組。一組以終濃度(5、10、20和50 nmol·L-1)硼替佐米于37 ℃、含有5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中共同孵育24 h，每個濃度設(shè)4個復孔；另外一組是用終濃度10 nmol·L-1硼替佐米與Raji細胞于37 ℃、含有5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中分別孵育24、48和72 h，每個時間點設(shè)4個復孔。在預(yù)定檢測時間點后，每孔加入20 μL MTT工作液，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)基，加入200 μL DMSO，搖床震蕩10 min充分溶解結(jié)晶物，酶標儀(ELX800，Bio-TEK，USA)檢測其波長570 nm處檢測OD值，實驗重復3次，計算細胞活力=(對照組OD值-實驗組OD值)/(對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。

1.4AnnexinV-FITC/PI雙染實驗取對數(shù)期Raji細胞，按照每毫升1×106個的密度接種于6孔板中，細胞分為兩組。一組以終濃度(5、10、20和50 nmol·L-1)硼替佐米于37 ℃、含有5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中共同孵育24 h；另外一組是用終濃度10 nmol·L-1硼替佐米與Raji細胞于37 ℃、含有5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中分別孵育24、48和72 h。在預(yù)定檢測時間點后，離心收集細胞(600×g·min-1離心5 min，并用冰PBS重懸2次)。用500 μL binding buffer重懸細胞，并加入5 μL Annexin V-FITC試劑避光孵育10 min，然后加入PI試劑避光孵育5 min。流式細胞儀(CytoFLEX，Beckman，USA)收集細胞，在激發(fā)光波長488 nm、發(fā)射光波長530 nm條件下分析細胞凋亡比例。

1.5Westernblotting實驗對數(shù)期Raji細胞以每毫升1×106個的密度接種于6孔板中，細胞分為兩組。一組以終濃度(5、10、20和50 nmol·L-1)硼替佐米于37 ℃、含有5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中共同孵育24 h；另外一組是用終濃度10 nmol·L-1硼替佐米與Raji細胞于37 ℃、含有5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中分別孵育24、48和72 h。在預(yù)定檢測時間點后，離心收集細胞(3 000×g·min-1離心5 min，并用冰PBS重懸2次)，加入細胞裂解液RIPA(其中含有蛋白酶抑制劑1 ∶1 000)，冰上裂解30 min，收集蛋白。離心(4 ℃，12 000×g·min-1)15 min。BCA蛋白定量試劑盒定量后調(diào)整各組蛋白上樣總量至30 μg。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)到PVDF上。室溫5%牛奶封閉1 h，加入一抗NF-κB p65抗體(1 ∶2 000稀釋)、p-NF-κB p65抗體(1 ∶2 000稀釋)、caspase-3(1 ∶4 000稀釋)、cleaved-caspase-3(1 ∶1 000稀釋)和GAPDH抗體(1 ∶5 000稀釋)，室溫育2 h，TBST洗PVDF膜3次，每次洗膜5 min，室溫孵育相應(yīng)比例的二抗1 h，TBST洗PVDF膜3次，每次洗膜10 min。暗室采用ECL化學發(fā)光法顯影。以GAPDH為內(nèi)參，ImageJ軟件分析目的條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1硼替佐米抑制Raji細胞活力本實驗選擇MTT法檢測硼替佐米對Raji細胞活力的影響。如圖1A所示，分別給予5、10、20和50 nmol·L-1硼替佐米處理Raji細胞24 h后，細胞活力分別為：80.6%±9.5%、65.4%±7.5%、51.3%±7.2%、40.8%±3.2%，與對照組(100.0%±0.0%)相比，硼替佐米濃度依賴性抑制Raji細胞活力(P<0.05)；如圖1B所示，10 nmol·L-1硼替佐米分別處理Raji細胞24、48和72 h后，細胞活力分別為：65.4%±7.5%、50.1%±3.2%、36.4%±1.8%，與對照組(100.0%±0.0%)相比，硼替佐米可時間依賴性抑制Raji細胞活力(P<0.05)。

2.2硼替佐米誘導Raji細胞凋亡本研究進一步采用選擇Annexin V-FITC /PI雙染流式細胞檢測硼替佐米對Raji細胞凋亡的影響。如圖2A所示，分別給予5、10、20和50 nmol·L-1硼替佐米處理Raji細胞24 h后，細胞早期凋亡分別為：6.2%±0.7%、9.2%±1.0%、13.1%±1.5%、19.4%±2.2%，細胞晚期凋亡分別為：7.8%±0.8%、14.8%±1.6%、16.5%±2.1%、28.2%±3.1%，與對照組早期凋亡(1.6%±0.2%)與晚期凋亡(2.2%±0.2%)相比，硼替佐米濃度依賴性促進Raji細胞凋亡(P<0.05)；如圖2B所示，10 nmol·L-1硼替佐米分別處理Raji細胞24、48和72 h后，細胞早期凋亡分別為：9.2%±1.0%、21.2%±2.8%、28.9%±3.4%，細胞晚期凋亡分別為：14.8%±1.6%、15.7%±1.8%、18.4%±2.1%，與對照組早期凋亡(1.6%±0.2%)與晚期凋亡(2.2%±0.2%)相比，硼替佐米可時間依賴性促進Raji細胞凋亡(P<0.05)。

注：A為終濃度5、10、20和50 nmol·L-1硼替佐米處理Raji細胞24 h后，MTT實驗檢測細胞活力(與0 nmol·L-1組比較，aP<0.05)。B為10 nmol·L-1硼替佐米處理Raji細胞24、48和72 h后，MTT實驗檢測細胞活力(與0 h組比較，bP<0.05)

圖1MTT實驗檢測硼替佐米對Raji細胞活性的影響

2.3硼替佐米促進Raji細胞cleavedcaspase-3蛋白表達本研究進一步采用選擇Western blotting法檢測硼替佐米對Raji細胞cleaved caspase-3蛋白表達的影響。如圖3A所示，分別給予5、10、20和50 nmol·L-1硼替佐米處理Raji細胞24 h后，cleaved caspase-3蛋白相對表達量分別為：0.32±0.06、0.48±0.05、0.59±0.07、1.22±0.18，與對照組(0.18±0.04)相比，硼替佐米濃度依賴性促進Raji細胞cleaved caspase-3蛋白表達(P<0.05)，而caspase-3表達差異無統(tǒng)計學意義；如圖3B所示，10 nmol·L-1硼替佐米分別處理Raji細胞24、48和72 h后，cleaved caspase-3蛋白相對表達量分別為：0.48±0.05、0.67±0.09、1.02±0.15，與對照組(0.18±0.04)相比，硼替佐米可時間依賴性促進Raji細胞cleaved caspase-3蛋白表達(P<0.05)，而caspase-3表達差異無統(tǒng)計學意義。

2.4硼替佐米抑制Raji細胞p-NF-κBp65蛋白表達NF-κB信號通路在細胞凋亡發(fā)揮重要作用。因此，本實驗采用Western blotting檢測硼替佐米對Raji細胞p-NF-κB p65蛋白表達的影響。如圖4A所示，分別給予5、10、20和50 nmol·L-1硼替佐米處理Raji細胞24 h后，p-NF-κB p65蛋白相對表達量分別為：0.18±0.06、0.08±0.02、0.04±0.01、0.02±0.01，與對照組(0.42±0.04)相比，硼替佐米濃度依賴性抑制Raji細胞p-NF-κB p65蛋白表達(P<0.05)，而NF-κB p65表達差異無統(tǒng)計學意義；如圖4B所示，10 nmol·L-1硼替佐米分別處理Raji細胞24、48和72 h后，p-NF-κB p65蛋白相對表達量分別為：0.08±0.02、0.03±0.01、0.02±0.00，與對照組(0.42±0.04)相比，硼替佐米可時間依賴性抑制Raji細胞p-NF-κB p65蛋白表達(P<0.05)，而NF-κB p65表達差異無統(tǒng)計學意義。

3 討論

伯基特淋巴瘤是一種高度侵襲性的淋巴瘤，多發(fā)生于兒童和青年人[1]。而伯基特淋巴瘤的治療方式多為傳統(tǒng)化療方式為主[4-5]。而傳統(tǒng)化療易出現(xiàn)毒副作用和耐藥性，導致臨床上治療效果不佳以及預(yù)后不良，因此，急需新的和毒副作用低的化療藥物。近來有報道論述，蛋白酶體活性異常會增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激，最終引起腫瘤細胞凋亡[13]。因此，抑制蛋白酶體活性已經(jīng)成為研究腫瘤治療新的方向[14]。硼替佐米作為二肽硼酸蛋白酶體抑制劑，具有干擾DNA修復、誘導細胞凋亡的作用，已用于套細胞淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的治療[12]。而硼替佐米治療伯基特淋巴瘤的作用和機制尚未完善，因此，本研究基于伯基特淋巴瘤Raji細胞觀察硼替佐米作用，有助于對臨床應(yīng)用硼替佐米治療伯基特淋巴瘤提供新的理論依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)硼替佐米濃度和時間依賴性抑制Raji細胞活力，并促進其凋亡。因此，我們推測硼替佐米治療伯基特淋巴瘤可能通過誘導其凋亡實現(xiàn)的。

注：A為濃度5、10、20和50 nmol·L-1硼替佐米處理Raji細胞24 h后，Western blotting檢測細胞cleaved caspase-3蛋白表達(與0 nmol·L-1組比較，aP<0.05)。B為10 nmol·L-1硼替佐米處理Raji細胞24、48和72 h后，Western blotting檢測細胞cleaved caspase-3蛋白表達(與0 h組比較，bP<0.05)

圖3Western blotting檢測硼替佐米對Raji細胞cleaved caspase-3蛋白表達的影響

注：A為終濃度5、10、20和50 nmol·L-1硼替佐米處理Raji細胞24 h后，Western blotting檢測細胞p-NF-κB p65蛋白表達(與0 nmol·L-1組比較，aP<0.05)。B為10 nmol·L-1硼替佐米處理Raji細胞24、48和72 h后，Western blotting檢測細胞p-NF-κB p65蛋白表達(與0 h組比較，bP<0.05)

圖4Western blotting檢測硼替佐米對Raji細胞p-NF-κB p65蛋白表達的影響

細胞凋亡是細胞機體一種復雜的程序化死亡進展，與眾多調(diào)控因子相關(guān)。NF-κB是轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，參與調(diào)控機體免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生進展等多種生命進程。眾多研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細胞凋亡時，NF-κB信號受到抑制[8-9]。比較直接的證據(jù)是硼替佐米可通過抑制IκBα降解和NF-κB轉(zhuǎn)位，阻滯套細胞淋巴瘤周期運行與促使其凋亡[15]。因此，本研究觀察硼替佐米對伯基特淋巴瘤Raji細胞p-NF-κB p65表達的影響，發(fā)現(xiàn)硼替佐米能濃度和時間依賴性下調(diào)Raji細胞中p-NF-κB p65表達，上調(diào)cleaved-caspase-3蛋白表達，最終誘導其凋亡。

綜上，可推測硼替佐米可能通過抑制NF-κB信號最終促進Raji細胞凋亡，從而起到抗伯基特淋巴瘤作用。

注：A為終濃度5、10、20和50 nmol·L-1硼替佐米處理Raji細胞24 h后，Annexin V-FITC /PI 雙染檢測細胞凋亡(與0 nmol·L-1組比較，aP<0.05)。B為10 nmol·L-1硼替佐米處理Raji細胞24、48和72 h后，Annexin V-FITC /PI 雙染檢測細胞凋亡(與0 h組比較，bP<0.05)

圖2Annexin V-FITC /PI 雙染檢測硼替佐米對Raji細胞凋亡的影響