華燕青，張楠

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100;2.西安市食品藥品檢驗所，陜西 西安 710065)

垂盆草(SedumsarmentosumBunge)為景天科植物，全草入藥，具有清熱解毒，活血利濕的功效，可用于治療帶狀皰疹，毒蛇咬傷、燙傷、燒傷及急慢性肝炎濕熱淤結(jié)癥[1]。垂盆草中富含垂盆草苷、黃酮類、三萜類、生物堿等多種化學(xué)成分[2]。研究表明[3-4]，垂盆草總黃酮是垂盆草中重要的保肝降酶作用的活性成分之一，垂盆草總黃酮中含有槲皮素、山柰素、木犀草素、苜蓿苷、槲皮苷、金絲桃苷、木犀草苷、異鼠李素等多種黃酮類化合物。垂盆草顆粒為現(xiàn)行2015年版藥典一部收載品種[5]，其含量測定采用紫外-可見分光光度法，以蘆丁為對照測定了垂盆草顆粒中總黃酮含量。未分別對各成分進行定量分析。為了客觀評價藥品的質(zhì)量，本研究自2015年12月至2016年6月建立了一種超高效液相色譜方法，同時測定垂盆草顆粒中三種黃酮類成分的含量，該方法高效準(zhǔn)確靈敏，可為提升垂盆草顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

DIONEX UltiMate3000 超高效液相色譜儀，四元分析泵，全自動進樣器，柱溫箱，UV檢測器，Chromeleon7.2工作站，BT124S型電子天平(德國賽多利斯)，1號垂盆草顆粒(杭州華東醫(yī)藥集團康潤制藥有限公司)批號：150303，150502，2號垂盆草顆粒(上海靜安制藥有限公司)批號：150915-2，150409-2。對照品：槲皮素(批號100081-201408)，山柰素(批號110861-201310)，異鼠李素(批號110860-201109)，對照品均購于中國藥品生物制品檢定所，供含量測定使用，甲醇為色譜純，水為雙蒸水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱Thermo Scientific AcclaimTM RSLC 120 C18(2.1 mm×100 mm，2.2 μm)，流動相：甲醇-0.4%磷酸(50 ∶50)；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：360 nm；進樣量：1 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液 分別精密稱取對照品槲皮素、山柰素、異鼠李素適量，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得對照品儲備液，分別精密量取上述儲備液適量，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL約含0.513 0 mg的槲皮素，0.254 5 mg的山柰素，0.260 5 mg 的異鼠李素的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液 精密稱取垂盆草顆粒2.0 g，置索氏提取器中，精密加入甲醇-25%鹽酸溶液(4 ∶1)的混合溶液25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取1 h，取出放冷后，再稱定質(zhì)量，用甲醇-25%鹽酸溶液(4 ∶1)的混合溶液補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3陰性對照溶液 按垂盆草顆粒制劑工藝方法，制備缺垂盆草的陰性樣品，按“2.2.2”項下制備方法，制成陰性對照溶液。

2.3系統(tǒng)適用性試驗分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各1 μL, 在“2.1”色譜條件下測定，理論板數(shù)分別以槲皮素、山柰素、異鼠李素計為18 000、10 015、9 800，各相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之間，陰性樣品對3個黃酮類成分的測定無干擾。各組分基線分離良好。色譜圖見圖1。

2.4線性范圍、最低檢測限和定量限分別精密量取“2.2.1”項下的混合對照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μL，置于1 mL量瓶中，加入甲醇定容，搖勻，作為系列對照溶液，按照“2.1”項下的色譜條件進樣測定各成分的峰面積積分值，以對照品的進樣量(μg)為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積積分值為縱坐標(biāo)進行線性回歸，槲皮素、山柰素、異鼠李素回歸方程及相關(guān)系數(shù)等見表1，三種成分峰面積與進樣量的線性良好。以3倍噪聲(S/N≥3)計算檢測限(LOD)，以10倍噪聲(S/N≥10)計算最小定量限(LOQ)，結(jié)果見表1。

2.5精密度試驗取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下的色譜條件連續(xù)進樣6次，測定峰面積，結(jié)果槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積的RSD分別為0.14%，0.32%，0.75%，表明儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗取1號垂盆草顆粒，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于放置0、2、4、8、12、16、20、24 h時進樣測定，記錄色譜峰面積，結(jié)果槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積的RSD分別為0.17%，0.43%，0.82%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7重復(fù)性試驗精密稱取1號垂盆草顆粒，按 “2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜峰。結(jié)果槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積的RSD分別為1.24%、1.8%、0.96%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率試驗精密稱取已測知含量的1號垂盆草顆粒樣品9份，每3份為一組，每份約1.0 g，精密稱定，按樣品含量的80%、100%和120%分別精密加入槲皮素、山柰素、異鼠李素對照品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積并計算槲皮素、山柰素、異鼠李素的平均回收率，結(jié)果見表2。

注：A為對照品；B為樣品；C為陰性樣品圖1 超高效液相色譜圖

成分回歸方程R值線性范圍/μgLOD/μgLOQ/μg槲皮素Y=465.858X+0.0800.999 950^1 0000.381.21山柰素Y=432.942X-0.3000.999 920^4000.461.26異鼠李素Y=204.272X-2.7710.999 620^4000.751.52

2.9樣品含量測定分別稱取兩個廠家各2批樣品適量，精密稱定，分別按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算樣品中槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

目前文獻已報道的垂盆草顆粒中黃酮類成分的測定方法有高效液相色譜法[6-8]和紫外-可見分光光度法[3]。超高效液相色譜法[9]是一種采用亞2 μm小顆粒填料的液相色譜技術(shù)，根據(jù)范德米特方程理論，通過降低顆粒度提高柱效和分析速度，增加分析的通量、靈敏度及色譜峰容量, 與HPLC簡單方便的方法轉(zhuǎn)換，可彌補傳統(tǒng)高效液相系統(tǒng)的不足。本實驗采用超高效液相色譜法進行含量測定，在10 min以內(nèi)即完成三種黃酮類成分的分離及檢測，分析時間縮短了5倍，同時該法的流速僅為0.3 mL·min-1，進樣體積為1 μL，流動相用量僅約為28 mL，而高效液相色譜法流速多為1.0 mL·min-1，進樣量為10 μL或20 μL，流動相用量較多。因此采取超高效液相色譜法進行測定可節(jié)約分析時間，減少溶劑消耗，極大地降低分析成本，提高了檢驗效率。

表2 加樣回收實驗(n=9)

表3 樣品含量測定結(jié)果(n=2)

本研究分別考察了甲醇、70%甲醇、甲醇-25%鹽酸(4 ∶1)三種提取溶劑，結(jié)果以甲醇-25%鹽酸(4 ∶1)為提取溶劑時3種成分的提取效率最高，并考察了索氏熱回流法、超聲提取法2種提取方式，30 min、45 min、1 h不同提取時間對黃酮成分提取率的影響，結(jié)果顯示索氏熱回流提取樣品1 h的提取效率最高，其有效成分含量較高、分離效果好。

參考相關(guān)文獻[8-10]，分別考察了甲醇-0.1%三氟乙酸水溶液、甲醇-0.4%冰乙酸水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液3 種流動相系統(tǒng)，并用多種不同配比進行試驗。結(jié)果采用甲-0.4%磷酸水(50 ∶50，V/V)為流動相，黃酮類成分色譜峰的峰形及分離效果最好。

綜上所述，本研究所建立的超高效液相色譜法快速準(zhǔn)確高效，重復(fù)性好。可作為控制垂盆草顆粒質(zhì)量的有效方法。