田文靜，楊燕，呂占云，孫祖真

作者單位濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科山東 濟(jì)寧 272000

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是臨床上較為常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，相關(guān)研究顯示PD近年來發(fā)病率呈現(xiàn)出一定上升趨勢[1,2]。臨床上PD的長期發(fā)生發(fā)展可以導(dǎo)致患者致殘率和病死率的上升，臨床預(yù)后不佳[3]。基因多態(tài)性可以通過影響到基因轉(zhuǎn)錄或者蛋白翻譯水平的相關(guān)變化，進(jìn)而影響相關(guān)靶物質(zhì)的表達(dá)。RAB7L1基因多態(tài)性可以通過影響到多巴胺類神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放，進(jìn)而影響到局部腦神經(jīng)元組織中的多巴胺的含量，進(jìn)而導(dǎo)致PD的發(fā)生發(fā)展[4,5]。RAB基因多態(tài)性研究可以為本地區(qū)PD的公共衛(wèi)生領(lǐng)域的預(yù)防或者決策提供參考。本研究選取PD患者200例，探討其RAB7L1基因rs1775143和rs823144位點(diǎn)的基因型分布，進(jìn)而為揭示基因多態(tài)性對于PD發(fā)生的影響提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年10月至2016年4月在我院就診的PD患者200例作為觀察組，其中男87例，女113例；年齡41～67歲，平均（51.01±8.32）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①濟(jì)寧地區(qū)漢族人群；②診斷符合英國帕金森協(xié)會腦庫標(biāo)準(zhǔn)[6]；③患者及家屬知情同意并且簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①繼發(fā)性PD綜合征；②合并惡性腫瘤等嚴(yán)重疾病。同時選取健康體檢者200例作為對照組，無PD家族史、自身免疫性疾病、腫瘤、感染及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其中男90例，女110例；年齡40～70歲，平均（50.92±9.42）歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.091，t=0.101，均P＞0.05）。

1.2 基因多態(tài)性檢測

取凍存血清保存液體，10 000 r/min離心分離，每1 mL TRIZOL試劑裂解樣品中加入0.2 mL氯仿，進(jìn)行裂解操作，4℃冰上采用無酶RNA沖洗液洗滌，再次10 000 r/min離心5 min，得到RNA?；旌弦合?0℃干浴3 min，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶 MMLV 0.5 μ L，37℃水浴60 min，室溫放置5 min使其完全溶解，使其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin為模版，在反應(yīng)體系中加入SYBR Green 1染料、上游引物、下游引物、dNTP，使總體積達(dá)20 μL ，上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃ 2 min、93℃ 1 min、55℃ 2 min，共40個循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行rs1775143和rs823144基因多態(tài)性檢測：參考multiplexkit試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）使用說明，加入各位點(diǎn)對應(yīng)延伸引物進(jìn)行單堿基測序反應(yīng)，并且在ABI1310（Life Technologies，美國）進(jìn)行電泳，結(jié)果用GENEMAPPER軟件（Life Technologies，美國）進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS19.0分析數(shù)據(jù)，采用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)樣本群體代表性。計量資料采用（±s)表示，組間比較使用t檢驗(yàn)，計數(shù)資料以率表示，組間比較使用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因型檢測

RAB7L1基因rs1775143位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增片段經(jīng)酶切后顯示3種基因型（TT型、CT型和CC型），rs823144位點(diǎn)顯示3種基因型（AA型、AC型和CC型），見圖1。

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

觀察組和對照組RAB7L1基因rs1775143和rs823144位點(diǎn)基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性，見表1，2。

2.3 2組受試者rs1775143和rs823144等位基因及基因型分布比較

2組rs1775143基因型和等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。2組rs823144基因型和等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

3 討論

自身免疫性因素、遺傳易感基因或者中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾病病史等，均可以導(dǎo)致PD的發(fā)生發(fā)展，特別是在年齡大于55歲的老齡人群中，PD的發(fā)病率更高，可較普通對照人群上升3～4倍[7]。近年來基礎(chǔ)研究顯示，基因水平的改變可以通過影響轉(zhuǎn)錄或者蛋白翻譯等環(huán)節(jié)，進(jìn)而影響相關(guān)基因的表達(dá)?；蚨鄳B(tài)性是靶基因的部分位點(diǎn)發(fā)生的基因突變，進(jìn)而導(dǎo)致基因或者基因型的改變，影響到中樞神經(jīng)系統(tǒng)遞質(zhì)的合成和釋放[8,9]。

RAB7L1基因是編碼多巴胺末端修飾蛋白的重要基因，其rs1775143和rs823144位點(diǎn)的多態(tài)性變化可以導(dǎo)致乙酰膽堿能神經(jīng)元的相對亢進(jìn)，患者可表現(xiàn)為震顫麻痹、手足徐動等癥狀[10,11]。另外，生物化學(xué)研究也顯示，RAB7L1基因相關(guān)位點(diǎn)的多態(tài)性問題，可以顯著影響神經(jīng)元對于多巴胺的再攝取[12,13]。本研究發(fā)現(xiàn)，rs1775143位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增片段經(jīng)酶切后顯示3種基因型（TT型、CT型和CC型），缺少G基因及A基因表位，提示rs1775143位點(diǎn)的基因突變主要向C或者T型等位基因轉(zhuǎn)變，而rs823144位點(diǎn)主要向A或者C型等位基因轉(zhuǎn)變。RAB7L1基因相關(guān)多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因在向?qū)?yīng)的基因轉(zhuǎn)換或者突變的過程中，白小燕等[14]和Roses等[15]研究通過回顧性分析82例樣本量的臨床資料，發(fā)現(xiàn)rs823144位點(diǎn)的C等位基因的比例可達(dá)35%以上，而A型等位基因的比例可達(dá)55%以上，二者占據(jù)總數(shù)的80%以上，C及A型等位基因共同構(gòu)成rs823144位點(diǎn)的多態(tài)性，這與本研究的結(jié)論較為一致。Hardy Weinberg平衡是反映所選樣本群體代表性的重要指標(biāo)，同時可以提供樣本統(tǒng)計結(jié)論的可靠程度，本研究中納入的rs1775143和rs823144位點(diǎn)相關(guān)等位基因的表達(dá)符合Hardy Weinberg平衡，提示所選樣本的代表性較為理想。

圖1 質(zhì)譜分型

表1 2組受試者rs1775143基因型分布（例）

表3 2組受試者rs1775143等位基因及基因型分布比較[例(%)]

表4 2組受試者rs823144等位基因及基因型分布比較[例(%)]

具體的基因型分析可以發(fā)現(xiàn)，rs1775143等位基因中CT或者CC型等位基因的比例較高，提示CT或者CC等位基因型可能對于多巴胺神經(jīng)元功能的影響更為顯著。rs823144等位基因中以AC或者CC等位基因的表達(dá)比例較高，提示AC或者CC等位基因的表達(dá)可能對于PD的發(fā)生更具有臨床意義。2組rs1775143基因型和等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）,提示rs1775143位點(diǎn)多態(tài)性可能與濟(jì)寧地區(qū)漢族人群PD的發(fā)生有一定關(guān)系；而2組rs823144基因型和等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）,提示rs1775143位點(diǎn)多態(tài)性可能與濟(jì)寧地區(qū)漢族人群PD的發(fā)生無關(guān)。

綜上所述，RAB7L1基因rs1775143位點(diǎn)的多態(tài)性與PD的發(fā)生具有密切關(guān)系，rs1775143等位基因中CT或者CC型與PD的發(fā)生關(guān)系更為密切。但本研究對于RAB7L1基因多態(tài)性與PD發(fā)生的具體內(nèi)在機(jī)制的研究不足，存在一定的局限性。