蘭宇貞 慕彰磊 趙 琰 孫 婧 張建中

苯烯莫德是一種小分子化合物，化學(xué)名為5-(2-苯乙烯基)-2-異丙基-1，3-苯二酚，是一種新型非激素類免疫調(diào)節(jié)劑[1]。國外一項(xiàng)臨床研究顯示，外用苯烯莫德乳膏對特應(yīng)性皮炎具有治療作用[2]，但其作用機(jī)制目前仍不清楚, 也無與糖皮質(zhì)激素及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑的對比研究?？ú慈?MC903)外用于BALB/c小鼠可誘導(dǎo)出紅斑、干燥、鱗屑、水腫、滲出、皮膚肥厚等特應(yīng)性皮炎(AD)樣皮膚癥狀，可見表皮增生，嗜酸細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞合成胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)，較好的復(fù)制了AD的重要特征[3,4]。MC903誘導(dǎo)的AD樣小鼠模型，已經(jīng)得到國際公認(rèn)。本研究利用MC903誘導(dǎo)的AD樣BALB/c小鼠模型，觀察外用苯烯莫德乳膏對AD的治療作用，并與糖皮質(zhì)激素及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑相比較，本研究還觀察了苯烯莫德治療對AD樣小鼠皮膚屏障功能及部分免疫反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 6周齡雌性BALB/c小鼠，購自北京維通利華公司(北京)。MC903購于Sigma公司。0.5%、1.0%苯烯莫德乳膏及乳膏基質(zhì)均由天濟(jì)藥業(yè)(深圳)有限公司提供。兔抗人TSLP抗體、兔抗人CD4抗體均購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及藥物處理 36只小鼠隨機(jī)分為6組，每組6只，即：正常對照組、基質(zhì)組、0.5%苯烯莫德組、1.0%苯烯莫德組、0.1%糠酸莫米松組和0.1%他克莫司組。正常對照組不予任何處理；分別將1 nmol(10 μL)MC903溶液均勻涂于其余小鼠的每側(cè)耳背皮膚，連續(xù)9天，于第10天對所有小鼠的耳部皮損進(jìn)行評(píng)分，并根據(jù)分組情況給藥治療12天。正常對照組不予任何藥物；其余小鼠每日上午8時(shí)涂抹1 nmol(10 μL)MC903溶液維持模AD模型，上午10時(shí)按分組涂抹50 μL相應(yīng)藥物于雙側(cè)耳背。

1.2.2 皮損評(píng)分 分別于治療前和治療12天后，對小鼠耳部皮損評(píng)分。評(píng)分根據(jù)癥狀分為紅斑/充血、鱗屑/干燥、水腫三項(xiàng)，每項(xiàng)根據(jù)癥狀的輕重程度評(píng)為0～3分：0(無癥狀)、1(輕度)、2(中度)、3(重度)。以三項(xiàng)評(píng)分相加所得總分評(píng)估皮損的嚴(yán)重程度。

1.2.3 耳部皮膚厚度測量和經(jīng)皮水丟失(TEWL)檢測 分別于治療前后，用游標(biāo)卡尺測量小鼠耳部厚度，并進(jìn)行記錄。治療12天后，使用經(jīng)皮水丟失記錄儀TewameterTM300對各組小鼠的耳背皮膚進(jìn)行經(jīng)皮水丟失(TEWL)測定。

1.2.4 HE染色及免疫組化 剪下小鼠耳部組織，將其中一側(cè)置于4%多聚甲醛固定24 h，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后，制備切片(4 μm)。HE染色，觀察各組小鼠皮損組織病理變化；分別使用兔抗人TSLP抗體、兔抗人CD4抗體進(jìn)行免疫組化染色，并于每張切片取3個(gè)高倍視野(×400)計(jì)數(shù)表達(dá)TSLP表皮細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞數(shù)量。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，每組前后比較采用配對樣本t檢驗(yàn)，各組比較采用One-way ANOVA分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 苯烯莫德治療對AD樣BALB/c小鼠耳部皮損評(píng)分的影響 AD樣小鼠雙側(cè)耳背表現(xiàn)出明顯紅斑、充血、干燥、水腫、鱗屑，耳部皮膚明顯增厚。治療12天后，0.5%苯烯莫德、1.0%苯烯莫德、0.1%糠酸莫米松及0.1%他克莫司組小鼠耳部紅斑、鱗屑、水腫及毛細(xì)血管擴(kuò)張程度均明顯減輕(圖1)。治療前后，AD樣小鼠皮損評(píng)分見表1。治療前基質(zhì)組、0.5%苯烯莫德組、1.0%苯烯莫德組、糠酸莫米松組、他克莫司組均高于正常對照組，AD樣小鼠各組之間無明顯差異。治療12天后，0.5%苯烯莫德乳膏組較治療前降低60.36%(t=25.298,P<0.001)；1.0%苯烯莫德乳膏組降低63.76%(t=9.286,P<0.001)，兩組評(píng)分均明顯低于同期基質(zhì)組(F=62.127,P<0.001)，與糠酸莫米松組差異無顯著性，1.0%苯烯莫德組顯著低于他克莫司組(P<0.05)，0.5%苯烯莫德組與他克莫司組及1.0%苯烯莫德組比較，差異無顯著性。見表1。

a:正常對照組; b:基質(zhì)組；c:0.5%苯烯莫德組；d:1.0%苯烯莫德組；e:0.1%糠酸莫米松組；f:0.1%他克莫司組

表1 治療前后各組小鼠皮損評(píng)分

注：n=6，與正常對照組比較a：P<0.01；與基質(zhì)組比較b：P<0.01

2.2 苯烯莫德治療前后耳部皮膚厚度變化 治療前AD樣小鼠耳部皮膚厚度高于正常對照組(F=89.113,P<0.01)。治療12天后， 1.0%苯烯莫德組、0.5%苯烯莫德組小鼠耳部皮膚厚度均較治療前減小(t值分別為14.050和15.704，均P<0.001)。治療組均小于基質(zhì)組，(F=111.725，均P<0.001)。其中，0.1%糠酸莫米松組明顯小于其他三組，P<0.05；1.0%苯烯莫德組、0.5%苯烯莫德組與他克莫司組無顯著性差異；1.0%苯烯莫德組小于0.5%苯烯莫德組，P<0.05。見表2。

2.3 苯烯莫德治療后AD樣BALB/c小鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)的變化 AD樣小鼠組織病理可見表皮顯著增生，棘層肥厚，角化過度及不全，表皮內(nèi)可見細(xì)胞間水腫，真皮淺中層毛細(xì)血管擴(kuò)張，血管周圍可見較致密的單一核細(xì)胞浸潤，并可見嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。與基質(zhì)組相比，治療組小鼠的表皮增生、單一核細(xì)胞浸潤及嗜酸粒細(xì)胞浸潤程度明顯減輕(圖2)。

2.4 苯烯莫德治療對AD樣BALB/c小鼠TEWL的影響 基質(zhì)組小鼠TEWL顯著高于正常對照組(F=19.319，P<0.001)；0.5%苯烯莫德組、1.0%苯烯莫德組、0.1%糠酸莫米松組、0.1%他克莫司組均顯著低于基質(zhì)組(P<0.01)；0.5%苯烯莫德組和1.0%苯烯莫德組均低于糠酸莫米松組(P<0.05)，與他克莫司組比較無顯著差異；0.5%苯烯莫德組與1.0%苯烯莫德組比較差異不顯著(圖3)。

表2 治療前后各組小鼠耳部皮膚厚度

注：n=6，與正常對照組比較a：P<0.01；與基質(zhì)組比較b：P<0.01

a：正常對照組; b：基質(zhì)組；c：0.5%苯烯莫德組；d：1.0%苯烯莫德組；e：0.1%糠酸莫米松組；f：0.1%他克莫司組

圖3 治療后各組小鼠經(jīng)皮水丟失程度(與基質(zhì)組比較：**P<0.01)

2.5 苯烯莫德治療對AD樣BALB/c小鼠皮損內(nèi)CD4+T細(xì)胞的影響 治療后，基質(zhì)組皮損內(nèi)CD4+T細(xì)胞浸潤程度顯著高于正常對照組?？匪崮姿山M、1.0%苯烯莫德組、0.5%苯烯莫德組和他克莫司組均較基質(zhì)組減輕(F=44.794，P<0.01)。0.5%和1.0%苯烯莫德組與0.1%糠酸莫米松組及0.1%他克莫司組比較均無顯著性差異，0.5%和1.0%苯烯莫德組之間比較差異亦不顯著(圖4、5)。

2.6 苯烯莫德治療對AD樣BALB/c小鼠皮損內(nèi)TSLP表達(dá)的影響 免疫組化結(jié)果顯示，與正常對照組相比，基質(zhì)組小鼠TSLP蛋白表達(dá)水平明顯升高，1.0%苯烯莫德組、糠酸莫米松組、他克莫司組和0.5%苯烯莫德組，均較基質(zhì)組下調(diào)(F=70.833，P<0.01)。其中，1.0%苯烯莫德組和0.1%糠酸莫米松組顯著低于0.5%苯烯莫德組(P<0.05)，其余各治療組之間無顯著性差異(圖6、7)。

a：正常對照組;b：基質(zhì)組；c：0.5%苯烯莫德組；d：1.0%苯烯莫德組；e：0.1%糠酸莫米松組；f：0.1%他克莫司組

圖5 CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)(與基質(zhì)組比較：**P<0.01)

3 討論

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatits，AD)是一種慢性炎癥性皮膚病，以劇烈瘙癢和復(fù)發(fā)性濕疹樣皮損為特征[5]。近年來，AD的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐年上升，部分國家兒童患病率超過20%，成人患病率為10%～20%[6]。AD的一線治療包括潤膚劑和外用藥物，目前AD的外用藥物以糖皮質(zhì)激素和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑為主，二者長期用藥均存在安全性隱患。

苯烯莫德是國家1.1類新藥，是一種新型非激素類免疫調(diào)節(jié)劑[7]。臨床研究顯示，外用苯烯莫德可以顯著而快速的減輕斑塊狀銀屑病的皮損，療效優(yōu)于糖皮質(zhì)激素及卡泊三醇[8]。苯烯莫德能促進(jìn)來源于白癜風(fēng)患者正常皮膚的黑素細(xì)胞系PIG3V細(xì)胞的增殖、遷移，使酪氨酸酶活性及黑素含量增加，可能直接促進(jìn)白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞發(fā)揮合成黑素的功能[9]。國外一項(xiàng)臨床研究顯示，與安慰劑組相比，外用苯烯莫德乳膏對輕到重度特應(yīng)性皮炎患者的濕疹面積及嚴(yán)重程度評(píng)分(EASI)、臨床SCORAD評(píng)分(包括瘙癢嚴(yán)重程度)均有明顯改善，且安全性較好[2]

a：正常對照組; b：基質(zhì)組；c：0.5%苯烯莫德組；d：1.0%苯烯莫德組；e：0.1%糠酸莫米松組；f：0.1%他克莫司組

圖7 表達(dá)TSLP的表皮細(xì)胞計(jì)數(shù)(與基質(zhì)組比較：**P<0.01)

本研究結(jié)果顯示，苯烯莫德可明顯減輕AD樣小鼠的紅斑、鱗屑及水腫癥狀，及耳部皮膚厚度。治療12天后AD樣小鼠耳部皮損評(píng)分較治療前顯著降低。治療后，小鼠耳部皮膚厚度明顯減小，其中1.0%苯烯莫德較0.5%苯烯莫德效果更好。提示苯烯莫德對AD具有較好的治療作用，且治療效果與苯烯莫德濃度相關(guān)。

AD的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，環(huán)境因素、遺傳因素、皮膚屏障功能受損及免疫系統(tǒng)異常均參與發(fā)病，并可相互作用。其中皮膚屏障功能及免疫異常是兩大主要因素，也是目前受關(guān)注最多的因素。

AD患者常出現(xiàn)特征性的皮膚干燥，以及TEWL增加，這意味著他們皮膚屏障功能受損[10]。本研究發(fā)現(xiàn)1.0%與0.5%苯烯莫德乳膏均可降低AD樣小鼠的TEWL程度，效果優(yōu)于0.1%糠酸莫米松，提示苯烯莫德乳膏有修復(fù)皮膚屏障的修復(fù)作用。AD樣小鼠耳部CD4+T細(xì)胞浸潤明顯，表皮細(xì)胞TSLP表達(dá)增加，這與AD的病理生理特征一致。本研究發(fā)現(xiàn)，苯烯莫德乳膏治療后，AD樣小鼠局部CD4+T細(xì)胞浸潤顯著減輕，TSLP表達(dá)下調(diào)，與0.1%糠酸莫米松及他克莫司組無顯著差異。TSLP可激活樹突狀細(xì)胞，刺激原始CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13及TNF-α，活化神經(jīng)元細(xì)胞和免疫細(xì)胞導(dǎo)致瘙癢產(chǎn)生，誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)胸腺和活化調(diào)劑趨化素(TARC/CCL17)和巨噬細(xì)胞趨化因子(MDC/CCL12)，而CCL17可以通過與Th2細(xì)胞表達(dá)的CC趨化受體4(CCR4)相結(jié)合從而趨化Th2細(xì)胞[11，12]。有研究顯示AD嚴(yán)重程度與血清TSLP及CCL17水平相關(guān)[13]。本研究結(jié)果提示苯烯莫德可減輕MC903誘導(dǎo)的AD樣小鼠的局部炎細(xì)胞浸潤，可能通過下調(diào)TSLP，抑制Th2細(xì)胞因子表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。