葉珊珊 李瑩潔 王東霞 李 卉 王再興

汗孔角化癥(porokeratosis，PK)是一種常染色體顯性遺傳的慢性角化不全性皮膚病，具有遺傳異質(zhì)性[1]。1875年Isidor Neuman首次發(fā)現(xiàn)此病特點(diǎn)，但于1893年被Vittorio Mibelli命名為“汗孔角化癥”[2]。繼斑塊型汗孔角化癥(porokeratosis of Mibelli，PM)被發(fā)現(xiàn)后，PK的其它幾種常見(jiàn)臨床亞型及少見(jiàn)特殊類(lèi)型陸續(xù)被認(rèn)識(shí)，而播散性淺表性光化性汗孔角化癥(DSAP)是最為常見(jiàn)的一種亞型。PK臨床表現(xiàn)可見(jiàn)中央萎縮，邊緣呈堤狀隆起的環(huán)狀斑塊，病理檢查以角化不全柱為其特征性表現(xiàn)[3]。其中，斑塊型汗孔角化癥(PM)常表現(xiàn)為單個(gè)或數(shù)個(gè)孤立性環(huán)狀的角化不全性皮損，少數(shù)可出現(xiàn)直徑達(dá)20 cm的斑塊[4]。PM常于兒童期發(fā)病，病變于四肢多見(jiàn)，但身體其他部位也可能受影響，如手掌、足底、口唇黏膜及生殖器部位[5]。臨床上極少出現(xiàn)不同類(lèi)型的汗孔角化癥同時(shí)出現(xiàn)在同一個(gè)體，但既往有報(bào)道表明PM可與淺表播散型、線(xiàn)狀型、疣狀斑塊型及播散性淺表性光化性汗孔角化癥共存[6]。同時(shí)，PM具有一定的惡變風(fēng)險(xiǎn)。由于PK的發(fā)病呈家族聚集性，進(jìn)一步證明遺傳因素在疾病發(fā)生具有重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)甲羥戊酸途徑相關(guān)酶突變與PK的發(fā)生密切相關(guān)，主要包括MVK、PMVK、MVD、FDPS[7]。其中MVK基因位于12q24.11，含有11個(gè)外顯子，約23 576 bp，仍是目前研究的熱點(diǎn)基因。早期研究認(rèn)為，MVK基因的突變?yōu)镈SAP主要的致病基因，后經(jīng)學(xué)者們進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，MVK與PM的發(fā)病同樣具有密切相關(guān)性。在本研究中，我們通過(guò)對(duì)1個(gè)斑塊型汗孔角化癥家系7例患者進(jìn)行了MVK基因的突變檢測(cè)，并進(jìn)一步明確MVK基因突變與PM發(fā)病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究對(duì)象為1個(gè)PM家系，其中包括先證者和6例家系患者，7例患者均具有典型PM臨床表現(xiàn)，其中先證者由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科專(zhuān)家確診，并行組織病理檢查進(jìn)一步明確。先證者臨床表現(xiàn)為：雙下肢及軀干部對(duì)稱(chēng)分布的呈黃豆至蠶豆大暗棕色環(huán)狀斑塊，邊緣呈堤狀隆起，中央見(jiàn)萎縮狀(圖1a)。皮膚組織病理可見(jiàn)典型的角化不全柱(圖1b)。該家系為3代，發(fā)病年齡在5～38歲不等(圖2)，家系其他6例患者皮損均較輕，病變部位于右下肢伸側(cè)單發(fā)多見(jiàn)(圖1c)，均為斑塊狀，偶伴有瘙癢不適癥狀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣本收集 在獲得該家系成員知情同意的情況下，我們抽取了7例發(fā)病患者和家系內(nèi)2名未發(fā)病健康對(duì)照的外周靜脈血液樣本各5 mL于EDTA抗凝管內(nèi)，并置于-80℃冰箱中保存。

1.2.2 外周血DNA提取 將冷凍樣本于常溫中解凍化開(kāi)。使用人外周血全血基因DNA提取試劑盒(QIAGEN，德國(guó))，按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序，提取該家系血液樣本中的DNA。并將提取到的DNA進(jìn)行純度檢測(cè)標(biāo)化。

1.2.3 PCR引物設(shè)計(jì) 通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)檢索出MVK基因外顯子序列，并應(yīng)用在線(xiàn)Primer3.0 軟件對(duì)MVK基因所有外顯子進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。所有引物由上海天昊生物科技有限公司合成。

1.2.4 PCR引物擴(kuò)增、純化 PCR反應(yīng)在2720型PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)上完成?？偡磻?yīng)體積為20 μL。擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性15 min；94℃變性15 s，62℃退火40 s，每循環(huán)減0.5℃，72℃延伸1 min，共11個(gè)循環(huán)；94℃變性15 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，共24個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸2 min，4℃保存。8 μL PCR產(chǎn)物與0.5 U 蝦堿性磷酸酶和4 U核酸外切酶混合，放入水浴鍋中，37℃孵育1 h，隨后75℃ 15 min將蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶滅活，取得純化PCR產(chǎn)物。

1.2.5 DNA序列分析 純化后的PCR產(chǎn)物采用3730XL遺傳分析儀直接測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果在Polyphred 軟件上進(jìn)行分析，同時(shí)將檢測(cè)出的結(jié)果與既往測(cè)得的676名健康對(duì)照的全部外顯子進(jìn)行比較[8]。

2 結(jié)果

通過(guò)對(duì)比MVK基因編碼區(qū)的全部外顯子及其側(cè)翼序列，在7例發(fā)病患者的6號(hào)外顯子上均發(fā)現(xiàn)c.604G>A(p.Gly202Arg)錯(cuò)義突變，即第604位的鳥(niǎo)嘌呤(G)突變?yōu)橄汆堰?A)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)序列的第202位甘氨酸突變?yōu)榫彼?圖3)。同時(shí)將該突變與676名健康對(duì)照的全部外顯子進(jìn)行對(duì)比后，未發(fā)現(xiàn)此突變。應(yīng)用SIFT和Polyphen工具對(duì)該突變進(jìn)行分析，得出分值分別為0和1，推算出該突變?yōu)橛泻ν蛔僛1]。

圖1 1a為先證者，下肢可見(jiàn)密集分布的暗棕色環(huán)狀斑塊，邊緣隆起，少許鱗屑；1b為先證者組織病理，鏡下可見(jiàn)角化不全柱，顆粒層消失，真皮血管擴(kuò)張，周?chē)准?xì)胞浸潤(rùn)(HE，×40)；1c為家系中發(fā)病患者，右下肢見(jiàn)兩個(gè)孤立性環(huán)狀斑塊

圖2 汗孔角化癥患者家系圖 圖3 家系突變檢測(cè)圖

3 討論

汗孔角化癥(PK)是一種少見(jiàn)的慢性進(jìn)行性角化不全的皮膚疾病，為常染色體顯性遺傳性疾病，具有遺傳異質(zhì)性。臨床上可見(jiàn)一個(gè)或多個(gè)邊緣堤狀隆起，中央萎縮的環(huán)狀斑塊，局部出現(xiàn)或散發(fā)于全身。角化不全柱為組織病理的特征表現(xiàn)。雖然目前對(duì)PK發(fā)生的病因尚不清楚，但認(rèn)為長(zhǎng)期紫外線(xiàn)照射、器官移植、臟器功能衰竭及免疫受抑等原因?qū)е陆琴|(zhì)形成細(xì)胞異?？寺∮嘘P(guān)[9,10]。結(jié)合本家系先證者臨床表型及組織病理，可明確診斷為PM，于1893年首先被Vittorio Mibelli認(rèn)識(shí)并命名的一種常見(jiàn)類(lèi)型的汗孔角化癥。在本家系中，發(fā)病患者可見(jiàn)與先證者類(lèi)似皮損，但多為單個(gè)或數(shù)個(gè)孤立性斑塊，于四肢多見(jiàn)，幼年至青年時(shí)發(fā)病，同樣符合PM診斷特點(diǎn)。

PM進(jìn)展緩慢，但可出現(xiàn)數(shù)量增多，皮損加重等情況，如本家系中的先證者，也可進(jìn)一步出現(xiàn)惡變可能。早在1942年首先由Vigne報(bào)道出，7%的斑塊型汗孔角化癥患者可能出現(xiàn)惡變趨勢(shì)。這種致癌潛能可能是由于角樣板層附近的角質(zhì)形成細(xì)胞中p53過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致的結(jié)果[11]。因而早期積極干預(yù)，定期隨訪(fǎng)是本病治療的一個(gè)關(guān)鍵措施。

近年國(guó)內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，甲羥戊酸途徑上相關(guān)酶基因突變，與汗孔角化癥的發(fā)生密切相關(guān)，其中主要包括MVK、PMVK、MVD、FDPS。早在2012年，國(guó)內(nèi)學(xué)者Zhang采用全基因組外顯子測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了MVK為播散性淺表性光化性汗孔角化癥(DSAP)的致病基因，但并未發(fā)現(xiàn)MVK與PM的發(fā)病具有關(guān)聯(lián)性[12]。隨后在2014年，Zeng通過(guò)全基因組測(cè)序的方法，在1個(gè)PM家系中，發(fā)現(xiàn)了MVK上的突變位點(diǎn)c.1039+1G>A，進(jìn)一步證實(shí)MVK參與了PM的發(fā)病[5]。2015年，Zhang等通過(guò)平行測(cè)序和外顯子拷貝數(shù)變異分析，發(fā)現(xiàn)PK患者中存在甲羥戊酸途徑相關(guān)酶的基因突變，其中23例PM患者為MVK突變，這進(jìn)一步明確，MVK與PM的發(fā)病密切相關(guān)[1]。在本次研究中，我們結(jié)合家系臨床表型并將該家系DNA進(jìn)行Sanger測(cè)序篩查后發(fā)現(xiàn)，在MVK基因上第6號(hào)外顯子，編碼序列為c.604 G>A的錯(cuò)義突變，是既往于播散性淺表性光化性汗孔角化癥(DSAP)患者中發(fā)現(xiàn)過(guò)的突變位點(diǎn)[1,12]，更加證實(shí)MVK是PM的致病基因。

根據(jù)近年國(guó)內(nèi)學(xué)者歸納的關(guān)于DSAP突變基因發(fā)現(xiàn)，MVK的突變率為60.3%，其突變熱點(diǎn)為c.395delT和c.604G>A，突變比率均為5.7%[13]。后一突變熱點(diǎn)與本家系突變一致，但不同的是，在本家系中該突變導(dǎo)致的臨床表型為斑塊型汗孔角化癥。結(jié)合本家系研究，猜測(cè)MVK上的c.604G>A突變?cè)诎邏K型汗孔角化癥及播散性淺表性光化性汗孔角化癥均能發(fā)生致病作用。

MVK基因編碼的甲羥戊酸激酶是甲羥戊酸途徑上的關(guān)鍵酶，此通路對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化具有重要作用，而MVK基因突變可能導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)功能及活性的改變，從而促進(jìn)了PK的發(fā)生。MVK基因上目前已發(fā)現(xiàn)40余種突變位點(diǎn)[14]。通過(guò)既往研究總結(jié)發(fā)現(xiàn)，MVK基因突變可見(jiàn)于多個(gè)臨床表型[15]，其中常見(jiàn)的有斑塊型PK、播散性淺表性PK、播散性淺表性光化性PK[14]和線(xiàn)狀PK。且在不同個(gè)體中，即使攜帶同一突變位點(diǎn)也可能出現(xiàn)不同的臨床表型，這可能與患者所處的生活狀態(tài)及環(huán)境因素密切相關(guān)。本文通過(guò)對(duì)1個(gè)PM家系進(jìn)行MVK基因的突變研究，檢測(cè)出了一個(gè)既往于DSAP患者中發(fā)現(xiàn)過(guò)的突變位點(diǎn)c.604 G>A，進(jìn)一步證明了MVK與PM的發(fā)病密切相關(guān)，更值得關(guān)注的是c.604 G>A為PM與DSAP共同的突變位點(diǎn)，這更加讓我們深刻地認(rèn)識(shí)到外界因素對(duì)遺傳疾病的臨床表型具有重要作用。