柯 鴻，潘龍瑞， 牛曉娟△

1. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院 血液內(nèi)科(十堰 442000 )；2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院 藥理學(xué)教研室(十堰 442000 )

1983 年 Barry J. Marshall和 J. Robin Warren首次在慢性活動(dòng)性胃炎患者的胃黏膜中分離出了幽門(mén)螺桿菌(H.pylori)，并通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究[1-3]逐漸證實(shí)了，感染H.pylori是引起人類(lèi)胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤(MALT)及胃癌等上消化道疾病的主要病因，進(jìn)而打破了傳統(tǒng)胃潰瘍學(xué)說(shuō)所認(rèn)為的胃潰瘍主要是由壓力、刺激性食物及胃酸分泌過(guò)多所引起的理論。H.pylori感染超過(guò)全世界50%的人口，其感染具有持續(xù)性和易復(fù)發(fā)性等特點(diǎn)，感染后很難被機(jī)體自然清除[4]。2012年Maastricht-IV 共識(shí)會(huì)議推薦的標(biāo)準(zhǔn)化治療H.pylori感染方案為質(zhì)子泵抑制劑、阿莫西林加上甲硝唑或克拉霉素的“三聯(lián)療法”[5]。但由于抗生素治療H.pylori感染易出現(xiàn)清除后再次感染，菌株耐藥現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重等問(wèn)題，從而使得H.pylori疫苗的研發(fā)顯得較為迫切[6]。令人振奮的是，中國(guó)率先研制出了“口服重組H.pylori疫苗”，成為世界上首個(gè)預(yù)防性H.pylori疫苗，其Ⅲ期臨床試驗(yàn)[7]結(jié)果顯示，在未感染H.pylori的6～15歲兒童體內(nèi)疫苗保護(hù)效率為71.8%。但針對(duì)H.pylori已感染人群，還缺乏有效的治療性疫苗。

本研究根據(jù)文獻(xiàn)[8-9]資料，查找出了H.pylori相關(guān)黏附分子，即鞭毛黏附素A亞單位(HpaA)、尿素酶A亞單位(UreA)、尿素酶B亞單位(UreB)抗原的10個(gè)顯性表位序列HpaA88-100、HpaA132-141、UreA27-53、UreA183-203、UreB229-251、UreB317-329、UreB321-339、UreB373-385、UreB438-452、UreB546-561，將表位序列串聯(lián)后，在其C端引入H.pylori黏附分子抗原細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白L (CagL)，并在其N(xiāo)端引入分子內(nèi)黏膜佐劑CTB，構(gòu)建了重組H.pylori多價(jià)疫苗靶抗原CTB-HpaA-UreA-UreB-CagL(CTB-HUUL)。初步研究了疫苗靶抗原CTB-HUUL的免疫原性及免疫反應(yīng)性，并探討了其對(duì)感染H.pyloriSS1的BABL/c小鼠模型的免疫治療效果。

1 材料與方法

1.1 小鼠及菌株

SPF級(jí)BABL/c小鼠，雌性，6周齡，體重14～18 g，購(gòu)自湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。H.pyloriSS1為本實(shí)驗(yàn)室傳代保種。

1.2 儀器與主要實(shí)驗(yàn)試劑

AKTA pure 25蛋白純化儀、Ni2+ Sepharose 6FF層析填料、HiLoad Superdex75 16/300分子篩層析預(yù)裝柱購(gòu)自GE公司；T4 DNA連接酶、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN；蛋白胨、酵母抽提物購(gòu)自O(shè)XOID公司；其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 疫苗靶抗原CTB-HUUL的設(shè)計(jì)與基因合成

通過(guò)Linker序列(EFM、GS、KK)將以下肽段序列進(jìn)行串聯(lián)，CTB、HpaA88-100、HpaA132-141、UreA27-53、UreA183-203、UreB229-251、UreB317-329、UreB321-339、UreB373-385、UreB438-452、UreB546-561、CagL，即CTB-HpaA-UreA-UreB-CagL(CTB-HUUL)。密碼子優(yōu)化后，由上海生工進(jìn)行基因合成。CTB-HUUL氨基酸序列如下：

MIKLKFGVFFTVLLSSAYAHGTPQNITDLCAEYHNTQIHTLNDKIFSYTESLAGKREMAIITFKNGA

TFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISMANEFMEQILQ

NQGYKVISKKDPKRTIQKKSGSGVKLNYTEAVALISARVMEKARDGNKSKKSVELIDIGGNRRIF

GFNALVDGSSAINHALDVADKYDVQVAIHTDTKKMLMVCHHLDKSIKKKCHHLDKSIKEDVQFA

DSRIKKITRTWQTADKNKKKKSPAFFGVKPNMIIKGKKFVDGKEVTSKPANKVSGSKNLDEIFST

TSPSANDKMGEEDALNIKKAAMALRGDLALLKANFEANELFFISEDVIFKTYMSSPELLLTYMKIN

PLDQKTAEQQCGISDKILVLYCEGKLKIEQEKQNIRERLETSLKAYQSNIGGTASLITASQTLVES

LKNKNFIKGIRKLMLAHNKFLNYLEELDALERSLEQSKRQYLQERQSS

1.4 重組質(zhì)粒pET28a(+)/CTB-HUUL構(gòu)建

將pET28a(+)載體、目的基因CTB-HUUL通過(guò)Nco I、Xho I限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收后，二者以分子摩爾比1∶3進(jìn)行酶連(16 ℃、2 h)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)中，LB固體平板倒置培養(yǎng)過(guò)夜(37 ℃)。第2天挑取單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確后，送上海生工進(jìn)行質(zhì)粒測(cè)序鑒定。

1.5 重組蛋白CTB-HUUL的表達(dá)及純化

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET28a(+)/CTB-HUUL轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)中。挑取單克隆至100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。第2天以1∶100接種至2 000 mL LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600約0.6，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，22 ℃、220 r/min繼續(xù)誘導(dǎo)18 h。5 000 r/min，離心半徑10 cm，離心20 min，收集菌體，PBS清洗菌體1次；超聲裂解液重懸菌體，超聲30 min；22 000 r/min，離心半徑10 cm，離心30 min，之后再重復(fù)離心1次，收集上清；0.22 μm過(guò)濾，備用。采用Ni Sepharose 6 FF層析填料進(jìn)行鎳離子親和層析純化，純化結(jié)合緩沖液為20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、10 mM咪唑，pH7.4；洗脫緩沖液為20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、500 mM咪唑，pH7.4。之后，將蛋白濃縮至5～10 mg/mL，采用HiLoad Superdex75 16/300預(yù)裝柱進(jìn)行分子篩層析純化，分子篩層析純化緩沖液為20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH7.4。SDS-PAGE檢測(cè)其純度后，調(diào)整其濃度為4 mg/mL，液氮速凍后，-80 ℃保存。

1.6 Western Blot

蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離(濃縮膠電壓80 V、10 min；分離膠120 V、60 min)，采用半干轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，調(diào)整電壓至24 V，恒壓轉(zhuǎn)PVDF膜1 h。TBST洗滌1次后進(jìn)行5%脫脂奶粉室溫封閉30 min，TBST洗滌4次，5 min/次。分別添加鼠抗H.pylori抗體(1∶1 000稀釋)(Thermofisher scientific，美國(guó))、鼠抗CTB抗體(1∶1 000稀釋)(Abcam，美國(guó))，室溫孵育2 h，TBST洗滌4次，5 min/次。再分別添加HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶10 000稀釋)(Sigma，美國(guó))，室溫孵育1 h，TBST洗滌4次，5 min/次。采用Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore，美國(guó))試劑進(jìn)行Werstern Blot顯影。

1.7 ELISA

采用ELISA包被液將重組蛋白rHpaA、rUreA、rUreB、rCagL稀釋至1 μg/mL，100 μL/孔，4 ℃過(guò)夜。PBST洗滌4次，封閉液37 ℃封閉2 h。抗體稀釋液稀釋待檢血清(PBS組、CTB組、CTB-HUUL組)，100 μL/孔加入酶標(biāo)板，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌4次，加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(1∶10 000)，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌4次，加入TMB底物顯色液100 μL/孔，37 ℃避光反應(yīng)15 min。各反應(yīng)孔中加入2 mol/L硫酸50 μL，終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值。

1.8 CTB-HUUL免疫治療效果評(píng)價(jià)

SPF級(jí)BABL/c小鼠，雌性，6周齡共18只，隨機(jī)分為3組，每組6只?？诜辔窰.pyloriSS1，菌落總數(shù)為108菌落形成單位(colony-forming units，CFU)，灌胃1 次/d，連續(xù)灌胃4次。末次灌胃后4周，CTB-HUUL組和CTB組口服灌胃重組蛋白200 μg/次，1次/周，連續(xù)免疫治療4次。PBS組按照同樣程序灌胃PBS。末次免疫后2周，脫頸處死小鼠，取出小鼠胃組織，沿著胃大彎一分為二。將其中1/2胃組織放入2 mL EP管中，組織勻漿器進(jìn)行勻漿，梯度稀釋?zhuān)坎加拈T(mén)螺桿菌選擇性固體平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；另外1/2胃組織進(jìn)行冰凍切片，HE染色。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pET28a(+)/CTB-HUUL酶切鑒定

pET28a(+)/CTB-HUUL經(jīng)Nco I、Xho I雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳時(shí)出現(xiàn)1條約1 500 bp的條帶，與CTB-HUUL基因理論大小1 521 bp一致。測(cè)序結(jié)果與CTB-HUUL基因理論序列100%一致，重組質(zhì)粒pET28a(+)/CTB-HUUL構(gòu)建正確(圖1)。

圖1 重組質(zhì)粒pET28a(+)/CTB-HUUL酶切鑒定

2.2 重組蛋白CTB-HUUL表達(dá)及純化

pET28a(+)/CTB-HUUL轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中，經(jīng)終濃度為0.5 mmol/L 的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的菌體在55 kDa處出現(xiàn)了目的蛋白條帶，與CTB-HUUL理論蛋白大小一致，灰度掃描結(jié)果顯示目的蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白的18.7%。重組蛋白CTB-HUUL經(jīng)鎳離子親和層析柱和分子篩預(yù)裝柱純化后，SDS-PAGE檢測(cè)其純度為93.1%(圖2)。

圖2 重組蛋白CTB-HUUL的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

2.3 Western Blot鑒定重組蛋白CTB-HUUL

重組CTB蛋白、重組CTB-HUUL蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，分別進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色及Western Blot分析。重組CTB-HUUL蛋白均可以與鼠抗CTB抗體及鼠抗H.pyloriSS1血清發(fā)生特異性反應(yīng)；而重組CTB蛋白只能與鼠抗CTB抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，卻不能與鼠抗H.pyloriSS1血清發(fā)生特異性反應(yīng)(圖3)。

圖3 Western Blot鑒定重組蛋白CTB-HUUL

2.4 ELISA鑒定重組蛋白CTB-HUUL的免疫原性及免疫反應(yīng)性

ELISA結(jié)果顯示，CTB-HUUL組小鼠血清體外均可以與重組蛋白rHpaA、rUreA、rUreB、rCagL發(fā)生特異性反應(yīng)，與CTB組、PBS組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。證實(shí)了重組H.pylori疫苗CTB-HUUL是多價(jià)疫苗，具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性(圖4)。

圖4 ELISA鑒定重組蛋白CTB-HUUL的免疫原性及免疫反應(yīng)性

2.5 口服重組H. pylori多價(jià)疫苗CTB-HUUL免疫治療效果

對(duì)口服重組H.pylori多價(jià)疫苗CTB-HUUL免疫治療效果，以免疫治療后小鼠胃組織H.pyloriSS1定植量、胃組織炎癥損傷程度2個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。免疫治療后小鼠胃組織H.pyloriSS1定植量，CTB-HUUL組與PBS組、CTB組相比較，定植量明顯降低(P<0.01)(圖5A)。免疫治療后小鼠胃組織炎癥損傷程度CTB-HUUL組較PBS組、CTB組損傷程度輕微，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少(圖5B)。

圖5 口服重組H. pylori多價(jià)疫苗CTB-HUUL免疫治療效果

3 討論

H.pylori是一種單極、末端鈍圓、多鞭毛、呈典型螺旋狀或螺桿狀的革蘭氏陰性細(xì)菌。人體胃部環(huán)境呈強(qiáng)酸性(pH值約為 1～2)，在此條件下H.pylori存活的時(shí)間極為短暫，因此，經(jīng)口進(jìn)入胃組織中的H.pylori必須盡快穿過(guò)胃黏液層，通過(guò)其黏附因子與胃上皮細(xì)胞上相應(yīng)的黏附因子受體結(jié)合，黏附并定植于胃上皮細(xì)胞層，進(jìn)而感染機(jī)體，引發(fā)一系列上消化道疾病。在此過(guò)程中，H.pylori表面的尿素酶、鞭毛及黏附因子扮演著重要角色。

尿素酶是H.pylori疫苗發(fā)展中最受關(guān)注并且廣泛使用的抗原，中國(guó)率先研制出的“口服重組H.pylori疫苗”正是以UreB為疫苗靶抗原的亞單位疫苗，Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示其在未感染H.pylori的6～15歲兒童體內(nèi)的疫苗保護(hù)率為71.8%[7]。尿素酶是一種能夠水解尿素的金屬酶，約占H.pylori菌體蛋白總量的10%～15%，其分子量約為550 kDa，其單體由A、B兩個(gè)亞單位組成(A、B兩個(gè)亞單位的相對(duì)分子量分別約為30、62 kDa，比例為1∶1，其中A亞單位為尿素酶活性部位，而B(niǎo)亞單位為結(jié)合部位，呈六聚體[10]。尿素酶水解尿素產(chǎn)生的氨能夠中和胃酸，升高H.pylori菌體周?chē)膒H，使得H.pylori能夠順利穿過(guò)胃黏液層到達(dá)胃黏膜表面，進(jìn)而達(dá)到定植和損傷胃組織的目的；尿素酶分解尿素產(chǎn)生的氨還可以改變胃黏液中黏蛋白的黏彈性，進(jìn)而更有利于H.pylori快速通過(guò)黏液層抵達(dá)胃黏膜[11]。

HpaA是表達(dá)在H.pylori表面的一種脂蛋白，為H.pylori定植所必需[12]。由于其在H.pylori不同菌株之間高度保守，因此，HpaA被認(rèn)為是最有潛力的H.pylori疫苗候選抗原之一。利用重組表達(dá)的HpaA蛋白口服免疫小鼠能夠激發(fā)出有效的抗H.pylori治療性免疫應(yīng)答[13]。

細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白 A (CagA)是 CagA+H.pylori編碼的一種重要毒力因子，由 Cag 致病島(Cag PAI)所編碼、經(jīng)H.pyloriⅣ型分泌系統(tǒng) (T4SS)分泌并注入胃上皮細(xì)胞內(nèi)，具有致癌作用[14]。CagL是H.pyloriⅣ型分泌系統(tǒng)纖毛狀結(jié)構(gòu)的一個(gè)表面蛋白，CagL可以與胃上皮細(xì)胞表面上的整合素α5β1跨膜受體結(jié)合，進(jìn)而介導(dǎo)CagA進(jìn)入宿主細(xì)胞，進(jìn)而造成細(xì)胞病變和疾病的發(fā)生[15]。

本研究選擇H.pylori黏附因子相關(guān)抗原HpaA、UreA、UreB及CagL作為口服重組H.pylori多價(jià)疫苗的靶抗原，但考慮到重組蛋白HpaA、尿素酶的脂溶性及分子量太大等問(wèn)題，因此，本研究根據(jù)文獻(xiàn)資料的報(bào)道，查找出了H.pylori相關(guān)黏附分子(HpaA、UreA、UreB)抗原的10個(gè)顯性表位序列HpaA88-100、HpaA132-141、UreA27-53、UreA183-203、UreB229-251、UreB317-329、UreB321-339、UreB373-385、UreB438-452、UreB546-561，將其串聯(lián)后，在其C端引入了CagL，并在其N(xiāo)端引入了分子內(nèi)黏膜佐劑CTB，構(gòu)建了重組H.pylori多價(jià)疫苗靶抗原CTB-HpaA-UreA-UreB-CagL(CTB-HUUL)。SDS-PAGE檢測(cè)CTB-HUUL蛋白純度為93.1%，可以很好滿足小鼠免疫治療要求；Western Blot結(jié)果顯示，CTB-HUUL蛋白均可以與鼠抗CTB抗體及鼠抗H.pyloriSS1血清發(fā)生特異性反應(yīng)；ELISA結(jié)果顯示，CTB-HUUL組小鼠血清體外均可以與重組蛋白rHpaA、rUreA、rUreB、rCagL發(fā)生特異性反應(yīng)，證實(shí)了CTB-HUUL為H.pylori多價(jià)疫苗，具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性。口服重組H.pylori多價(jià)疫苗CTB-HUUL的免疫治療效果顯示，CTB-HUUL組小鼠胃組織H.pylori SS1培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果較CTB組和PBS組明顯降低(P<0.01)，CTB-HUUL組小鼠胃組織炎癥損傷程度及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度較CTB組和PBS組輕微。

綜上所述，本研究獲得了純度為93.1%的口服重組H.pylori多價(jià)疫苗靶抗原CTB-HUUL，其具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，BABL/c小鼠口服CTB-HUUL后體內(nèi)的H.pylori定植量和病理?yè)p傷程度均得到了明顯降低。