馬曉平，楊秋霞，俞 演，李德生，王承東 ，凌珊珊，古 玉

(1.四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 成都611130； 2.中國大熊貓保護研究中心，四川 雅安 625000; 3.四川農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，四川 雅安 625014)

枝孢樣枝孢霉(Cladosporiumcladosporioides)屬于引起暗色絲孢霉病的枝孢霉屬暗色孢科真菌[1]。其在環(huán)境中濃度較高，一般不會對機體產(chǎn)生威脅，在特定條件下能夠引起人和動物的淺部感染，是近30年才報道的條件性致病暗色真菌。近年來隨著環(huán)境變化以及各種抗生素等藥物的濫用，由枝孢樣枝孢霉引起人和動物的暗色絲孢霉病越來越多，世界各國先后報道了由該菌引起的人和動物的皮下真菌病[2]、角膜炎[3]、鼻竇炎、腦炎、腎炎[4]等多種疾病。2012年馬曉平等[5]發(fā)現(xiàn)了一例由枝孢樣枝孢霉引起的大熊貓皮膚病。對枝孢樣枝孢霉的免疫原性研究中發(fā)現(xiàn)枝孢樣枝孢霉的分生孢子體和菌絲體中所含的過敏原成分基本相同，而在分生孢子內(nèi)的過敏原總濃度高于菌絲提取物的過敏原總濃度[6]。但由于對枝孢樣枝孢霉的基本微生物學特性及致病機制缺乏了解，對由該菌引起疾病的診治仍是難點。本課題組在大熊貓皮膚病灶上分離出致病菌枝孢樣枝孢霉Z20，在此基礎(chǔ)上，通過微波結(jié)合亞硝基胍誘變的方式獲得了相對于原菌株表型改變，對小鼠致病力減弱的弱毒株Zt[7]。本次實驗對枝孢樣枝孢霉野生株(Z20)和突變株(Zt)培養(yǎng)特性、形態(tài)學、菌絲多糖含量、藥物敏感型作了進一步的研究，為其診斷、治療、預防以及致病機制的研究做鋪墊。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

供試菌株Z20為大熊貓皮膚病患處分離并鑒定的枝孢樣枝孢霉純菌株(登錄號：JQ727688.1)；Zt為通過微波誘變結(jié)合亞硝基胍誘變獲得的突變株(登錄號：KR084328)，均由本實驗室提供。

1.2 主要儀器

MJ-400B霉菌培養(yǎng)箱購自蘇州凈化設(shè)備科技有限公司；CP214電子天平購自上海奧豪斯儀器有限公司；THZ-C恒溫振蕩儀購自太倉市實驗設(shè)備廠；BX51熒光顯微鏡及DP70照相系統(tǒng)購自日本奧林巴斯；H-600A-2型透射電鏡購自日本日立；以及其他實驗室常規(guī)設(shè)備。

1.3 主要試劑及培養(yǎng)基

1.3.1 主要藥品試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基購于成都康迪生物技術(shù)有限公司；二甲亞砜(DMSO)、灰黃霉素(Y29J7C9597)、酮康唑(SM0325YF13)購于上海源葉制藥廠；環(huán)吡酮胺(P02854)購于阿達瑪斯；氟康唑(RK4168S305)、伊曲康唑(RK2186S31)購于上海瑞勇制藥廠。根據(jù)M-38A配置灰黃霉素、酮康唑、氟康唑、伊曲康唑、磺吡酮胺儲存液，氟康唑水溶性溶于無菌水，其余4種藥物脂溶性溶于二甲亞砜[8]。

1.3.2 主要培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、沙保羅培養(yǎng)基(SDA)制備法見參考文獻[9]。

2.5%戊二醛固定液配制。(a) 0.2 mol·L-1磷酸緩沖液的配方：準確稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4·H2O)2.6 g，磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)29 g，加入蒸餾水至500 mL，用1 mol·L-1HCl 將pH調(diào)至7.4。(b) 取25%戊二醛10 mL，0.2 mol·L-1磷酸緩沖液50 mL， 蒸餾水約40 mL定容至100 mL配得2.5%戊二醛。

1.4 菌落形態(tài)學及生長速率的測定

將保存菌株Z20與Zt分別接種于SDA培養(yǎng)基上進行復蘇，培養(yǎng)7 d后用滅菌打孔器沿菌落邊緣切下直徑5 mm的菌塊接種于滅菌的PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察菌株的顏色、質(zhì)地、形態(tài)、生長快慢，十字交叉法測量菌落大小，每個處理重復3次。用透明膠帶黏取菌落經(jīng)乳酸棉藍染色后顯微鏡觀察。

1.5 枝孢樣枝孢霉Z20與Zt的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)比較

按常規(guī)方法制作透射電鏡標本進行觀察[10]。將復蘇后的菌株Z20和Zt接種于沙氏培養(yǎng)液中25 ℃，150 r·min-1常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的菌落，離心去掉培養(yǎng)液，用滅菌生理鹽水沖洗3次，投入2.5%的戊二醛固定液中室溫下固定6 h并制成瓊脂塊，經(jīng)1%鋨酸后固定、滴膜、常規(guī)方法脫水(乙醇-丙酮系列梯度脫水)、定向包埋(Epon-812包埋劑包埋)、超薄切片(60～80 nm)，經(jīng)醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色后，在H-600A-2型透射電鏡下觀察，拍照。

1.6 菌絲體多糖含量測定

標準曲線的制定：精確稱取已干燥至恒定質(zhì)量的葡萄糖40.0 mg，加入適量水溶解，于100 mL容量瓶中定容，搖勻，配成濃度為400 μg·mL-1的標準葡萄糖儲備液。使用時，再分別稀釋成50、100、125、150、175、200、250、300 μg·mL-1的使用濃度，準確移取蒸餾水0.2 mL和上述葡萄糖使用液各0.2 mL置于干燥的具塞試管中，加入0.05 g·mL-1苯酚溶液0.8 mL，混合均勻后，迅速加入4 mL濃硫酸，混勻后，室溫放置30 min，在波長為485 nm處測定吸光度，以加入蒸餾水的溶液做空白。以葡萄糖的濃度(μg·mL-1)為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制吸光度-葡萄糖濃度關(guān)系曲線[11]。

菌絲體多糖制備：取菌絲體置于預冷無菌的研缽中，在冰浴下研磨至粉末，稱取0.4 g粉末菌體，至濾紙袋中，用40 mL 85%乙醇于60 ℃浸提30 min，重復2次，棄乙醇后加入20 mL蒸餾水，沸水浴中提取2 h后定容至100 mL。按標準曲線測定方式測定菌絲體的吸光度值，并測定菌絲體的多糖含量。

1.7 常見抗真菌藥物的MIC測定

1.7.1 菌懸液的制備

取于SDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周的菌株Z20和Zt，各自用1 mL滅菌生理鹽水反復沖洗吹打菌落表面，將菌懸液用雙層無菌紗布濾掉菌絲，將菌懸液置于無菌試管中，振蕩混勻，用血球計數(shù)板調(diào)整菌懸液濃度為(0.40～5.00)×106cfu·mL-1，再用RPMI-1640培養(yǎng)基將菌懸液進行1∶50稀釋為2倍濃度的菌懸液，4 ℃冷藏備用。

1.7.2 藥敏板的制備

藥物稀釋：5種抗真菌藥物灰黃霉素、伊曲康唑、酮康唑、環(huán)吡酮胺、氟康唑。氟康唑用滅菌蒸餾水配成1 600 μg·mL-1，其余4種藥物(非水溶性藥物)用100%的二甲亞砜(DMSO)溶解配成1 600 μg·mL-1的儲備液，-20 ℃保存?zhèn)溆??；尹S霉素和氟康唑的藥物濃度使用范圍0.125～64.000 μg·mL-1，伊曲康唑、酮康唑和磺吡酮胺的使用范圍0.0313～16 μg·mL-1。

1.7.3 菌懸液接種及結(jié)果判讀

將制備好的藥敏試驗板在室溫下溶解，在96 孔板的1-11列中每孔加入100 μL的2 倍終濃度的菌懸液，11列為生長對照，含有100 μL菌懸液與100 μL培養(yǎng)基，12列為陰性對照，只含有200 μL RPMI1640培養(yǎng)基。將藥敏試驗板置于25 ℃培養(yǎng)(靜置)，5～7 d讀取結(jié)果。結(jié)果判定的前提為第12 孔陰性對照培養(yǎng)基清晰透明，11列生長對照生長良好，將每孔生長情況與11列對比，若該孔出現(xiàn)渾濁，那么前1孔的藥物濃度判定為相應菌株的MIC值。重復3次，結(jié)果由2人在光線較好的條件下判讀，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)學及生長速率變化

枝孢樣枝孢霉Z20與Zt分別接種于PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)，突變株表面為灰白色絨毛狀，邊緣為白色菌絲；野生株表面為深灰色，邊緣有少量白色菌絲。隨著時間加長，突變株邊緣白色菌絲減少，中部呈現(xiàn)橄欖綠色；野生株表面皺褶加深(圖1)。

將菌株Z20與Zt培養(yǎng)4 d后用棉藍染色進行顯微鏡下觀察，Z20與Zt菌絲無明顯變化，均為分隔菌絲，有分枝。野生株菌株Z20孢子量高于突變株，孢子形態(tài)無明顯變化(圖2)。

培養(yǎng)第1天Z20與Zt生長均緩慢，突變株Zt的速率略高于野生株Z20，培養(yǎng)第2天之后突變株的生長速率快于野生株的生長速率(圖3)。

2.2 枝孢樣枝孢霉Z20與Zt的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)比較

在透射電鏡下觀察到菌株Z20和Zt的超微結(jié)構(gòu)無顯著性差異，但存在部分區(qū)別，未見典型的梭形分生孢子(圖4)。菌體的基本結(jié)構(gòu)不變，均包括由細胞壁、細胞核、細胞膜以及細胞器。其中包裹在最外層的細胞壁較厚，其內(nèi)側(cè)依次為細胞膜、原生質(zhì)、細胞器和胞液。與其他常規(guī)的營養(yǎng)菌絲相比，菌株Zt和Z20的菌絲細胞的邊緣部位有較多的由嗜鋨內(nèi)含體所導致的大小不等的黑色顆粒狀的電子密集體。

A， Zt 1 d；B， Z20 1 d；C， Zt 2 d；D， Z20 2 d；E， Zt 3 d；F， Z20 3 d；G， Zt， 4 d；H， Z20 4 d；I， Zt 5 d；J， Z20 5 d；K， Zt 6 d；L， Z20 6 d；M， Zt 7 d；N， Z20 7 d.

圖2 枝孢樣枝孢霉Z20(A)和Zt(B)顯微鏡下形態(tài)(1 000×)Fig.2 Microscopic morphology of Cladosporium cladosporioides Z20 (A) and Zt (B)

圖3 枝孢樣枝孢霉Zt與Z20的菌落生長曲線Fig.3 Colony growth curve of Cladosporium cladosporioides Z20 and Zt

枝孢樣枝孢霉Z20和Zt在TEM下均有真菌細胞質(zhì)中核糖體等基質(zhì)成分流失，細胞質(zhì)電子密度降低以及成分丟失所造成的空泡狀。細胞質(zhì)中有散在的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及擴張的線粒體。細胞壁密度較高，尤其是外側(cè)緣邊界清楚，內(nèi)側(cè)邊界較模糊，但可以看到細胞壁向內(nèi)凹陷形成的皺褶。細胞壁內(nèi)側(cè)的細胞膜不明顯，在該視野中未見細胞核，細胞質(zhì)內(nèi)可以看見有低電子密度的膜狀物包裹或分隔形成的囊狀物，可見透明大小不同的空泡。枝孢樣枝孢霉Z20和Zt菌體多呈橢圓形，細胞質(zhì)內(nèi)線粒體等細胞器清晰，菌絲的細胞壁厚度與菌絲寬度稍有差別，Z20細胞壁厚度約為0.30 μm，菌絲寬度約為3.25 μm；Zt的細胞壁厚度約為0.15 μm，菌絲寬度約為2.50 μm。枝孢樣枝孢霉野生株Z20的孢子長約1.50 μm，寬約1.00 μm，孢子內(nèi)部未見豐富的細胞器。

2.3 菌絲體多糖含量測定

2.3.1 葡萄糖標準曲線的繪制

以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線如圖5所示，在50～300 μg·mL-1范圍內(nèi)葡萄糖X與吸光度值Y呈良好的線性關(guān)系，所得的標準曲線回歸方程式為Y=0.009 5X+0.006 5，相關(guān)系數(shù)r=0.999 5。

A，菌株Zt菌絲縱切，15 000 ×；B，菌株Zt菌絲橫切，20 000 ×；C，菌株Z20菌絲縱切，15 000 ×；D，菌株Z20菌絲橫切，20 000 ×；E，菌株Z20孢子，20 000 ×。A， Longitudinal of Zt mycelium, 15 000 ×; B， Crosscutting of Zt mycelium, 20 000×; C， Longitudinal of Z20 mycelium, 15 000 ×; D， Crosscutting of Z20 mycelium, 20 000 ×; E， Spores of Z20, 20 000×.

圖5 葡萄糖標準曲線圖Fig.5 Glucose standard curve

2.3.2 菌株Z20和Zt的菌絲體多糖含量比較

對菌株Z20和Zt的菌絲體多糖含量測定的結(jié)果表明：Z20的含量為(38.21±0.51) μg·mg-1，Zt的含量為(34.32±0.48) μg·mg-1，Z20顯著(P=0.019，P<0.05)高于Zt。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

枝孢樣枝孢霉菌株Z20和Zt在RPMI1640培養(yǎng)基上生長良好，培養(yǎng)第6天陰性對照孔第12孔澄清透明無菌體生長，生長對照孔第11孔生長良好。其中菌株Zt結(jié)果(表1)顯示：灰黃霉素MIC值為64 μg·mL-1；伊曲康唑MIC值為0.25 μg·mL-1；酮康唑MIC值為2 μg·mL-1；環(huán)吡酮胺MIC值為4 μg·mL-1；氟康唑MIC值為8 μg·mL-1。菌株Z20的結(jié)果顯示：灰黃霉素MIC值為32 μg·mL-1；伊曲康唑MIC值為0.50 μg·mL-1；酮康唑MIC值為4 μg·mL-1；環(huán)吡酮胺MIC值為8 μg·mL-1；氟康唑MIC值為32 μg·mL-1。

3 討論

3.1 枝孢樣枝孢霉Z20與Zt的生長特征對比

枝孢樣枝孢霉野生株Z20與突變型Zt連續(xù)培養(yǎng)，從菌落形態(tài)上可以發(fā)現(xiàn)菌株Z20的菌落顏色較Zt明顯更深，Z20在顯微鏡下觀察到的分生孢子在數(shù)量上明顯高于Zt，由此可以推測菌落的顏色的深淺變化可能與孢子的數(shù)量及顏色變化相關(guān)。有研究表明色素的減少可以促使孢子的顏色變淺，使其致病力降低，在體內(nèi)更容易受到巨噬細胞的吞噬和殺傷[12]。張宇[13]通過傳代誘導致病力強的煙曲霉菌，獲得了產(chǎn)孢量少、生長速度變慢、致病力明顯減弱的菌株。結(jié)合前期關(guān)于菌株Z20和Zt的致病力的研究結(jié)果，菌株Zt對于小鼠的致病力明顯低于Z20，可以推測突變株的分生孢子在動物體內(nèi)更容易受到吞噬細胞的吞噬和殺傷，從而被機體清除 。

表1 Z20和Zt對5種抗真菌藥物的最小抑菌濃度Table 1 Minimal inhibitory concentration of Z20 and Zt to 5 antifungal drugs μg·mL-1

暗色絲孢霉病是由多種條件致病性暗色絲孢霉科真菌引起的皮下組織、皮膚的炎性肉芽腫、囊腫、膿腫及系統(tǒng)性感染的深部真菌病，其中最重要的就包括枝孢霉屬[10]。我們就枝孢樣枝孢霉Z20與Zt超微結(jié)構(gòu)的不同進行研究，以期明確二者之間致病性差異的問題。枝孢樣枝孢霉Z20與Zt的超微結(jié)構(gòu)存在一定的差異，菌株Z20的菌絲的寬度及菌絲壁的厚度均高于菌株Zt，而同一種菌絲的細胞壁的厚度稍有差別提示該菌處于不同的時期或發(fā)育階段。真菌菌絲的有無分隔以及分隔的不同與真菌的分類標準相關(guān)，如子囊菌和半知菌的菌絲有中央孔，在本實驗中均未發(fā)現(xiàn)明顯差異。Z20與Zt在透射電鏡均發(fā)現(xiàn)有大量的空泡及囊狀物，皆是由于細胞質(zhì)中核糖體等基質(zhì)成分的流失所引起的細胞質(zhì)中電子密度的降低，甚至于成分基本丟失而呈現(xiàn)出的空泡狀。

3.3 菌絲體多糖含量

近年來，微生物多糖由于其廣泛的應用價值，優(yōu)良的性質(zhì)，以及其不受地域、季節(jié)和蟲害的限制等優(yōu)點，已逐漸發(fā)展成具有極強市場競爭力和廣闊發(fā)展前景的新興產(chǎn)業(yè)[14]。菌絲體內(nèi)的多糖含量不僅與其生物價值相關(guān)，更與其在環(huán)境中的適應能力相關(guān)。

由于單糖能夠溶于乙醇，多糖不溶于乙醇，在提取菌株Z20和Zt的菌絲體多糖時，用85%的乙醇去除單糖以防止其對測定結(jié)果產(chǎn)生干擾[15]。運用硫酸-苯酚法[16-17]測定菌絲體內(nèi)多糖含量，多糖在硫酸的作用下水解為單糖，單糖脫水形成醛衍生物，衍生物再與苯酚結(jié)合生成有色化合物，該化合物在485 nm處有最大吸收。此方法操作簡單，靈敏度高，顯色穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。在測定過程中所使用的空白對照需統(tǒng)一，做到樣品的測定條件相同。加入濃硫酸的過程由于其大量的散熱對結(jié)果影響較大應直接將濃硫酸加入樣品而非沿壁加入導致時間難以控制，反應體現(xiàn)顏色差別較大標準曲線不準。通過研究我們發(fā)現(xiàn)，枝孢樣枝孢霉Z20的菌絲體多糖含量高于菌株Zt，差異顯著，表明枝孢樣枝孢霉Z20與Zt相比菌絲體的多糖含量更為豐富，在環(huán)境中的適應耐受能力極有可能更強。

3.4 枝孢樣枝孢霉Z20和Zt的常見藥物藥敏分析

暗色絲孢霉病是由暗色真菌引起的以組織中有暗色菌絲為特征的皮膚、皮下或系統(tǒng)性感染。但是大多數(shù)的暗色絲孢霉病對抗真菌藥物不敏感，療效欠佳[18]。本研究參照美國臨床試驗標準委員會(NCCLS)提出的《產(chǎn)孢絲狀真菌的液基稀釋抗真菌藥敏試驗參考方案》(M38-P)[19-20]進行。

通過對枝孢樣枝孢霉Z20和Zt進行微量藥敏試驗，伊曲康唑?qū)χ︽邩又︽呙筞20和Zt抑菌效果最好，研究表明伊曲康唑治療口腔念珠病、馬拉色菌毛囊炎等效果較好且副作用少[21-22]，且通過聯(lián)合用藥更有利于治療真菌病，如與克霉唑聯(lián)合治療陰道念珠菌[23-24]，與鹽酸特比萘芬聯(lián)合治療甲真菌病[25-26]，其效果均優(yōu)于單一藥物治療效果。