代 琳，徐媛媛，熊 博，黃勝佳，孫國(guó)超，2，汪志輝，2，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，四川 成都 611130； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 果蔬研究所，四川 成都 611130)

黃果柑屬于蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citrus)，是我國(guó)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的天然雜交柑橘[1]，其果實(shí)原產(chǎn)于四川省雅安市石棉縣，翌年3～5月成熟，具有極豐產(chǎn)、無(wú)核、酸甜適口、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)良性狀[2-4]。黃果柑果實(shí)中有機(jī)酸(organic acid)和抗壞血酸(ascorbic acid，亦稱維生素C)是品質(zhì)形成的重要因素，其含量直接影響果實(shí)的內(nèi)在品質(zhì)[5]。有機(jī)酸作為植物的初生和次生代謝產(chǎn)物，在植物機(jī)體發(fā)育過(guò)程的細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)和平衡細(xì)胞內(nèi)過(guò)量陽(yáng)離子方面起重要的調(diào)控作用[6]。其中，柑橘有機(jī)酸主要來(lái)自三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，包括檸檬酸、酒石酸、奎寧酸等[7-10]。植物體內(nèi)還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)作為脫氫抗壞血酸(dehydroascorbate，DHA)的電子受體，與還原型抗壞血酸(L-ascorbic acid，AsA)偶聯(lián)形成AsA-GSH循環(huán)(Ascorbate-glutathione cycle)[11]，在植物體清除自由基、光保護(hù)、抵抗環(huán)境脅迫等方面起重要作用，同時(shí)維持和平衡AsA和GSH的氧化還原能力[12-14]。該循環(huán)中抗壞血酸的降解代謝會(huì)導(dǎo)致有機(jī)酸的形成，柑橘類主要形成草酸[13]，而草酸與抗壞血酸降解代謝的互作機(jī)理鮮有報(bào)道[15]。本試驗(yàn)主要探究黃果柑果實(shí)發(fā)育過(guò)程中抗壞血酸、谷胱甘肽與有機(jī)酸的積累特性，為黃果柑果實(shí)提質(zhì)增效提供一定的理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2016—2017年在四川省雅安市石棉縣先鋒鎮(zhèn)黃果柑果園進(jìn)行。選擇9株健壯的黃果柑樹(shù)(樹(shù)勢(shì)基本一致，無(wú)病蟲(chóng)害，8 a生，生長(zhǎng)狀況良好且株行距3 m×4 m)作為試驗(yàn)用樹(shù)。從花后60 d開(kāi)始，每21 d采樣1次，共計(jì)采樣13次。每次采樣時(shí)，在每棵樹(shù)樹(shù)冠外圍同一高度(高約1.6 m)東、西、南、北、中5個(gè)方位隨機(jī)各采1個(gè)果實(shí)，每個(gè)樣共5個(gè)果實(shí)，置于干冰中帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 試劑

標(biāo)準(zhǔn)品有檸檬酸、奎寧酸、蘋果酸、富馬酸、草酸、乳酸、丙酮酸和抗壞血酸，均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；抗壞血酸純度在99%以上，其他標(biāo)準(zhǔn)品純度均在98%以上。谷胱甘肽試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 谷胱甘肽和抗壞血酸含量測(cè)定

總抗壞血酸(total glutathione，T-AsA)、AsA和DHA是黃果柑果實(shí)中抗壞血酸的主要組分?？箟难崽崛⒖祭钣衩鞯萚16]的方法進(jìn)行改進(jìn)：稱取混合黃果柑果肉樣品0.5 g，加0.2%偏磷酸研磨，定容至6 mL，4 ℃ 12 000 g離心15 min；取上清液，過(guò)0.22 μm水性濾膜后，取1 mL用于AsA測(cè)定；取3 mL加入10 μL 0.2 mol·L-1二硫蘇糖醇黑暗處理4 h后，用于T-AsA測(cè)定；DHA含量為T-AsA和AsA含量的差值。

抗壞血酸采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測(cè)定，色譜條件：安捷倫1260液相色譜儀，C18色譜柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，流動(dòng)相為甲醇和0.2%偏磷酸(pH 2.5)體積比為15∶85，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，243 nm波長(zhǎng)處測(cè)定。

總谷胱甘肽(total glutathione，T-GSH)、氧化型谷胱甘肽(glutathione oxidized，GSSG)和還原型谷胱甘肽(GSH)是黃果柑果實(shí)中谷胱甘肽的主要組分。谷胱甘肽提取和測(cè)定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒。

1.3.2 有機(jī)酸含量測(cè)定

有機(jī)酸提取參考李云康[17]的方法，有機(jī)酸采用HPLC測(cè)定，色譜條件：安捷倫1260液相色譜儀，C18色譜柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相為3%甲醇水溶液，用磷酸調(diào)pH至2.6，流速0.8 mL·min-1，波長(zhǎng)210 nm。最終含量以每100 g鮮質(zhì)量中所含毫克數(shù)計(jì)，以mg·100g-1表示。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和圖表制作，采用SPSS 22.00軟件，以P<0.05為顯著水平，對(duì)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性、主成分和通徑分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃果柑果實(shí)發(fā)育過(guò)程中抗壞血酸含量變化

黃果柑果實(shí)抗壞血酸在5 min內(nèi)被完全分離且效果較好，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行定性，抗壞血酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性含量范圍均符合樣品的含量。從圖1可知，黃果柑果實(shí)發(fā)育過(guò)程中抗壞血酸組分和含量均呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性變化，T-AsA、AsA和DHA含量分別為22.15～37.98、21.11～33.73和1.07～7.38 mg·100g-1。AsA和DHA含量占抗壞血酸的比例分別為78.34%～95.30%、1.07%～7.38%，表明AsA是黃果柑果實(shí)中抗壞血酸的主要存在形式。

黃果柑果實(shí)發(fā)育期間，T-AsA、AsA和DHA含量隨著果實(shí)發(fā)育均呈“M”變化趨勢(shì)，花后60～123 d(幼果期)逐漸上升；花后123～165 d(膨大期)逐漸下降；花后165～228 d(轉(zhuǎn)色期)快速上升，T-AsA和AsA含量在花后228 d達(dá)到最大值，分別為37.98和33.73 mg·100g-1，DHA含量在花后249 d達(dá)到最大值7.38 mg·100g-1；花后228～312 d(成熟期)有所下降；DHA含量在花后291～312 d快速上升。說(shuō)明T-AsA和AsA主要在果實(shí)幼果和轉(zhuǎn)色期積累，成熟后期DHA的氧化能力大幅度提高，導(dǎo)致T-AsA和AsA含量下降。表明在果實(shí)成熟過(guò)程中抗壞血酸的氧化性不斷提高，而還原性逐漸下降，從而影響T-AsA含量的積累，導(dǎo)致抗氧化能力減弱。

不同時(shí)間無(wú)相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；數(shù)據(jù)以鮮質(zhì)量計(jì)。下同。Values without the same lower letters at different time indicate significant difference at P<0.05; Data was detected based on fresh weight. The same as below.

AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中AsA/DHA可以衡量抗壞血酸的氧化還原能力。由圖2可知，AsA/DHA隨著果實(shí)發(fā)育呈“降—升—降”變化趨勢(shì)，花后60 d AsA/DHA最高，為22.63；花后60～123 d AsA/DHA迅速降低，花后123 d達(dá)到最低值4.43；花后123～165 d逐漸上升，花后186～312 d緩慢下降。說(shuō)明AsA/DHA氧化還原能力在幼果期快速降低，果實(shí)膨大期緩慢升高，成熟期相對(duì)較低。

2.2 黃果柑果實(shí)發(fā)育過(guò)程中谷胱甘肽含量變化

由圖3可知，黃果柑果實(shí)發(fā)育過(guò)程中T-GSH、GSH和GSSG含量分別為106.23～290.52、58.99～186.37和30.21～105.76 μmol·L-1，GSH和GSSG含量占谷胱甘肽比例分別為53.42%～76.78%和23.21%～46.57%，表明GSH是黃果柑果實(shí)谷胱甘肽的主要存在形式。

黃果柑果實(shí)發(fā)育過(guò)程中T-GSH、GSH和GSSG含量均呈“M”型變化趨勢(shì)?；ê?0～123 d上升，花后123 d達(dá)到最大值，分別為290.52、186.37、105.76 μmol·L-1；花后123～165 d下降，其中，T-GSH和GSH含量在花后165 d降到最低，分別為106.23、58.99 μmol·L-1；T-GSH含量在花后165～207 d緩慢上升，207～312 d相對(duì)穩(wěn)定；GSH含量在花后228～249 d呈上升趨勢(shì)，其后緩慢下降；GSSG含量在花后165～207 d緩慢上升，花后207～270 d緩慢降低，花后270 d降至最低，為30.21 μmol·L-1，其后緩慢上升。說(shuō)明谷胱甘肽含量在黃果柑幼果期不斷升高，膨大期急劇下降，在果實(shí)成熟時(shí)期相對(duì)穩(wěn)定。

總體上，花后60～228 d的GSH/GSSG較低，為1.19～1.63；花后228～270 d迅速上升，花后270 d達(dá)到最高，為2.31；花后270～312 d急劇下降(圖4)。說(shuō)明果實(shí)幼果期至轉(zhuǎn)色期谷胱甘肽氧化還原能力相對(duì)較低，成熟期較高。

圖2 黃果柑果實(shí)發(fā)育過(guò)程中AsA/DHA變化Fig.2 Changes of AsA/DHA during fruit development of Huangguogan

2.3 黃果柑果實(shí)發(fā)育過(guò)程中有機(jī)酸含量變化

在黃果柑果實(shí)發(fā)育過(guò)程中檢測(cè)出了7種有機(jī)酸，其均能在15 min內(nèi)被完全分離。從圖5得知，黃果柑果實(shí)發(fā)育過(guò)程中有機(jī)酸組分含量差異顯著，總酸含量為1 350.31～7 731.14 mg·100g-1；檸檬酸含量最高，為641.10～4 192.85 mg·100g-1，在總酸中占比47.48%～78.85%；蘋果酸、奎寧酸和乳酸含量分別為46.23～4 692.71、31.35～691.28和54.9～696.13 mg·100g-1；富馬酸、草酸和丙酮酸含量均在55 mg·100g-1以下。

圖3 黃果柑果實(shí)發(fā)育過(guò)程中T-GSH、GSSG和GSH含量變化Fig.3 Changes of T-GSH， GSSG and GSH content during fruit development of Huangguogan

圖4 黃果柑果實(shí)發(fā)育過(guò)程中GSH/GSSG變化Fig.4 Changes of GSH/GSSG during fruit development of Huangguogan

圖5 黃果柑果實(shí)發(fā)育過(guò)程中有機(jī)酸含量變化Fig.5 Changes of organic acid content during fruit development of Huangguogan

黃果柑果實(shí)發(fā)育過(guò)程中有機(jī)酸除了檸檬酸、乳酸和富馬酸外，其他酸含量總體呈“L”變化趨勢(shì)。檸檬酸含量的呈“降—升—降”變化，在花后60～102 d急劇下降，花后102～123 d上升，花后123 d含量達(dá)3 100.34 mg·100g-1，花后123～228 d快速下降，花后228 d含量降至最低，為640.10 mg·100g-1；乳酸含量變化規(guī)律呈“M”趨勢(shì)，花后60～144 d含量急劇上升，花后144～165 d呈下降狀態(tài)，花后165～207 d又快速上升且花后207 d達(dá)到最大值696.13 mg·100g-1，之后略有下降且保持相對(duì)穩(wěn)定；花后60～165 d奎寧酸含量急劇下降，花后165～228 d保持相對(duì)穩(wěn)定，在花后228 d時(shí)降至最低值為31.35 mg·100g-1，其后呈上升趨勢(shì)；草酸、丙酮酸和蘋果酸含量在花后60～102 d急劇下降，花后102 d含量分別降至12.07、10.2和253.43 mg·100g-1，之后保持相對(duì)穩(wěn)定；在花后60～81 d，富馬酸含量急劇上升，花后81 d含量達(dá)到最大值50.25 mg·100g-1，花后81～207 d下降，花后207 d降至最低值15.30 mg·100g-1。表明黃果柑中有機(jī)酸的積累以檸檬酸積累為主，檸檬酸含量在果實(shí)發(fā)育前期逐漸降低，在果實(shí)發(fā)育中后期保持相對(duì)穩(wěn)定；在果實(shí)發(fā)育前期其他組分逐漸下降，果實(shí)發(fā)育中期逐漸上升，但成熟期時(shí)有機(jī)酸各組分含量逐漸下降。

2.4 抗壞血酸、谷胱甘肽和有機(jī)酸含量的相關(guān)性

由表1可知，黃果柑果實(shí)發(fā)育過(guò)程中T-AsA、AsA與DHA含量均呈極顯著正相關(guān)；DHA與GSH呈極顯著正相關(guān)，但T-AsA與T-GSH之間的相關(guān)性不顯著；抗壞血酸與GSH/GSSG、乳酸均呈極顯著正相關(guān)，與AsA/DHA、GSSG、檸檬酸、奎寧酸、蘋果酸、草酸和丙酮酸均呈極顯著負(fù)相關(guān)；T-GSH與GSSG、檸檬酸、奎寧酸、草酸和富馬酸均呈極顯著正相關(guān)，與GSH呈顯著正相關(guān)；GSSG與檸檬酸、奎寧酸和富馬酸呈極顯著正相關(guān)，與草酸呈顯著正相關(guān)，但與GSH/GSSG呈極顯著負(fù)相關(guān)；GSH與GSH/GSSG呈極顯著正相關(guān)。有機(jī)酸各組分之間均呈極顯著正相關(guān)，而其他酸與乳酸呈極顯著負(fù)相關(guān)；富馬酸與丙酮酸相關(guān)性不顯著。

2.5 AsA-GSH循環(huán)中抗氧化物質(zhì)和有機(jī)酸含量的主成分分析

由表2可知，第1主成分的貢獻(xiàn)率最大，為53.072%，第2主成分的貢獻(xiàn)率為17.416%，第3主成分的貢獻(xiàn)率為14.339%，第4主成分的貢獻(xiàn)率為7.768%。4個(gè)主成分的特征值大于1且累積貢獻(xiàn)率達(dá)到92.594%，綜合了抗壞血酸、谷胱甘肽和有機(jī)酸含量的大部分信息。

表3所示為4種主成分的載荷矩陣。第1主成分(F1)反映指標(biāo)主要為蘋果酸、草酸、丙酮酸、奎寧酸、乳酸和AsA/DHA；第2主成分(F2)反映指標(biāo)主要為檸檬酸、富馬酸、GSSG和T-GSH；第3主成分(F3)反映指標(biāo)主要為GSH、GSH/GSSG和DHA；第4主成分(F4)反映指標(biāo)主要為AsA和T-AsA。利用數(shù)學(xué)模型對(duì)4個(gè)因子進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，因子得分F1為0.128，F(xiàn)2為0.327，F(xiàn)3為0.341，F(xiàn)4為0.534，綜合得分為0.262；說(shuō)明AsA和T-AsA對(duì)主成分的影響相對(duì)較大。

表1 抗壞血酸、谷胱甘肽和有機(jī)酸的相關(guān)系數(shù)Table 1 Correlation coefficient of ascorbic acid， glutathione and organic acid

“*”表示在0.05水平上顯著相關(guān)，“**”表示在0.01水平上顯著相關(guān)。下同。

“*” represents the correlation is significant atP<0.05 level， “**” represents the correlation is significant atP<0.01 level. The same as below.

表2主成分的特征值及貢獻(xiàn)率
Table2Eigenvalues and contribution of principal component

主成分Principlecomponent特征值Eigenvalue貢獻(xiàn)率Contributionrate/%累積貢獻(xiàn)率Cumulativecontribution rate%17.96153.07253.07222.61217.41670.48732.15114.33984.82641.1657.76892.594

表3 主成分載荷矩陣Table 3 Loading matrix of principle components

2.5 谷胱甘肽和有機(jī)酸含量的通徑分析

以T-GSH含量為因變量，以檸檬酸、蘋果酸、奎寧酸、草酸、乳酸、富馬酸和丙酮酸為自變量進(jìn)行通徑分析，把有機(jī)酸含量與T-GSH含量的相關(guān)系數(shù)分解為直接作用和間接作用，以明確有機(jī)酸組分含量與T-GSH的效應(yīng)大小。通過(guò)軟件比對(duì)和篩選得出，檸檬酸、草酸與T-GSH呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別是0.806和0.537，檸檬酸、草酸對(duì)T-GSH的直接通徑系數(shù)分別為0.609、0.248，間接通徑系數(shù)分別為0.649和0.735(表4)，表明檸檬酸和草酸對(duì)T-GSH含量影響的直接和間接通徑系數(shù)較大。

3 結(jié)論與討論

有機(jī)酸和抗壞血酸是黃果柑果實(shí)品質(zhì)形成的重要因素[18]，本試驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化HPLC方法，較為精確地測(cè)定黃果柑果實(shí)發(fā)育過(guò)程中有機(jī)酸和抗壞血酸的含量。結(jié)果表明，黃果柑果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期各項(xiàng)物質(zhì)含量存在顯著性差異，隨著果實(shí)成熟，在花后165～312 d，有機(jī)酸和抗壞血酸各組分含量幾乎全部呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。

表4 黃果柑果實(shí)中檸檬酸、草酸和T-GSH含量的通徑分析Table 4 Path analysis of citric acid， oxalic acid and T-GSH contents in Huangguogan fruit

黃果柑果實(shí)中共檢測(cè)出7種有機(jī)酸，以檸檬酸為主。果實(shí)發(fā)育過(guò)程中除乳酸以外，其他有機(jī)酸總體呈不同程度的下降趨勢(shì)，這與高陽(yáng)等[19]和文濤等[20]的研究結(jié)果基本一致。果實(shí)成熟時(shí)，有機(jī)酸含量大小為檸檬酸>奎寧酸>蘋果酸>草酸>丙酮酸>乳酸，這與Yamaki等[21]在臍橙上的研究結(jié)果不一致，推測(cè)柑橘中不同品種間有機(jī)酸各組分含量的積累可能存在一定差異，也表明隨著黃果柑果實(shí)的逐漸成熟，有機(jī)酸逐漸降解，檸檬酸含量降解最多，這可能與黃果柑果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期的有機(jī)酸代謝途徑有關(guān)。

黃果柑果實(shí)發(fā)育過(guò)程中AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中抗壞血酸和谷胱甘肽存在的主要形式分別為AsA與GSH。隨著果實(shí)發(fā)育，AsA/DHA氧化還原能力總體呈“降—升—降”變化，這可能是酸、酚類、類黃酮等代謝途徑相互作用的結(jié)果。在果實(shí)發(fā)育前期抗壞血酸代謝抗氧化能力和GSH/GSSG氧化還原能力保持相對(duì)穩(wěn)定，成熟期呈“升—降”趨勢(shì)，說(shuō)明伴隨著果實(shí)成熟，AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)抗氧化能力逐漸減弱，這與前人[22-23]結(jié)果相似，這可能是由果實(shí)AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中抗壞血酸和谷胱甘肽的積累特性和遺傳基因決定的。

T-AsA與T-GSH之間的相關(guān)性不顯著，抗壞血酸與AsA/DHA、GSH/GSSG均呈極顯著正相關(guān)，這表明AsA/DHA與GSH/GSSG對(duì)T-AsA的積累與維持有重要作用。這與侯長(zhǎng)明[24]研究結(jié)果不同，推測(cè)是黃果柑果實(shí)發(fā)育各時(shí)期AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中氧化還原酶活性變化對(duì)T-AsA含量產(chǎn)生了影響。T-AsA與GSSG含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，這與蒲飛[25]結(jié)果不一致，這可能因?yàn)镚SH是DHA再生的電子供體，T-AsA含量受DHA的調(diào)控，GSH含量變化間接影響T-AsA的含量，而在谷胱甘肽代謝過(guò)程中GSSG與GSH所起的作用相反。T-AsA、AsA、DHA和有機(jī)酸中主要組分均呈顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明抗壞血酸和有機(jī)酸含量積累成反比，為果實(shí)綜合品質(zhì)的衡量提供了一定的理論依據(jù)。

AsA和T-AsA對(duì)主成分的影響相對(duì)較大，檸檬酸和草酸對(duì)T-GSH的影響較大，而AsA與草酸呈極顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明有機(jī)酸對(duì)T-GSH含量的變化起著重要作用，間接影響AsA含量。因此，黃果柑果實(shí)發(fā)育過(guò)程中AsA降解可能導(dǎo)致草酸和檸檬酸生成，這與前人[13，15]研究結(jié)果不完全一致，可能是因?yàn)閷俜N之間的代謝途徑不同，代謝產(chǎn)物存在一定差異。檸檬酸與T-GSH含量的相關(guān)性鮮有報(bào)道，T-GSH與檸檬酸和草酸的具體互作機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。