熊 英，樊 璞，沈楚楚，周瑞鵬，陳 驍

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023)

哮喘是兒童最常見的呼吸道疾病，包括過敏原在內(nèi)的有害刺激誘發(fā)急性氣道炎癥而未能及時(shí)消退并轉(zhuǎn)為慢性炎癥，是哮喘的重要病理特征,這與哮喘患者體內(nèi)存在內(nèi)源性特異性促炎癥消退介質(zhì)(specialized proresolving mediators，SPMs)調(diào)控障礙、促炎介質(zhì)水平升高密切相關(guān)[1]。脂氧素A4(lipoxin A4，LXA4)是研究最多的一類SPMs，能有效對(duì)抗促炎介質(zhì)的作用，促進(jìn)哮喘急性炎癥的消退[2]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，痰飲內(nèi)伏是哮喘發(fā)生的內(nèi)因，脾為生痰之源，為肺之母，小兒脾又常虛，所以脾虛是兒童哮喘的重要病理特點(diǎn)之一[3]。捏脊法是防治兒童哮喘的常用外治法，有較好的臨床效果[4],但其機(jī)制尚未見深入研究。本研究旨在觀察脾虛對(duì)哮喘大鼠脂質(zhì)介質(zhì)中前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes，CysLTs)促炎介質(zhì)及LXA4水平的影響以及捏脊法的干預(yù)效應(yīng)，以期為捏脊法防治兒童哮喘提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

SPF級(jí)雄性SD大鼠44只，體質(zhì)量(44.72±3.26) g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供(許可證號(hào)SCXK(滬)2007-0005)。普通飲食喂養(yǎng)，室溫22±2 ℃，濕度50%～70%，光照適度，通風(fēng)及潔凈程度良好。將SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組8只，哮喘組、脾虛哮喘組、捏脊脾虛哮喘組各12只,大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 藥物、試劑及儀器

脾虛造模所用中藥材由南京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂門診部提供。中藥冷水浸泡30 min，常規(guī)煎煮2次合并藥液，濃縮至1 mL/g原藥材。卵蛋白(OVA，Grade V，Sigma公司，貨號(hào)A5503)，大鼠LXA4、CysLTs、PGE2酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供)，Rayto RT-6100酶標(biāo)分析儀、霧化器(江蘇魚躍器械有限公司)。

1.3 脾虛哮喘大鼠模型的建立(圖1)

圖1 脾虛哮喘大鼠模型建立流程

1.3.1 脾虛模型的建立 參考文獻(xiàn)[5]方法建立脾虛模型。以厚樸、枳實(shí)、大黃按3∶3∶2的比例濃縮成100%煎劑,1 g/mL隔日灌胃1次,每次1.5 mL/100 g/體質(zhì)量,喂藥當(dāng)日禁食不禁水,次日喂飼不限，喂養(yǎng)44 d。在脾虛造模結(jié)束時(shí)，造模大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降、食量減少、倦怠少動(dòng)、飲水增多、肛溫升高等癥狀，符合脾虛證標(biāo)準(zhǔn)。正常對(duì)照組和哮喘組以自來水灌胃。

1.3.2 哮喘模型的建立 參考文獻(xiàn)[6]采用OVA致敏和激發(fā)方法建立哮喘模型，在脾虛造模完成后的第1天(實(shí)驗(yàn)第45天)和第8天(實(shí)驗(yàn)第52天)分別腹腔注射OVA/AL(OH)3混合液1.5 mL(內(nèi)含OVA 1 mg, AL(OH)3凝膠1.5 mL) 致敏，脾虛造模后第15天(實(shí)驗(yàn)第59天)始定時(shí)給予1% OVA霧化器噴霧激發(fā)，每次30 min，連續(xù)3 d(實(shí)驗(yàn)第59～61天)。當(dāng)激發(fā)時(shí)大鼠出現(xiàn)呼吸喘促、點(diǎn)頭、腹肌抽動(dòng)等呼吸困難癥狀，提示哮喘模型造模成功。正常對(duì)照組致敏與激發(fā)均以生理鹽水代替OVA。

1.4 捏脊法干預(yù)

捏脊法操作：一助手以一只手輕撫按大鼠頭部，另一手輕持鼠尾根部將大鼠固定。操作者先以一手四指腹面輕撫大鼠脊柱中央背部皮膚，從大椎至脊中線尾根部共3遍；而后以雙手拇食指緊靠，輕輕對(duì)稱提起大鼠背部沿中線兩側(cè)的皮膚，以指腹相對(duì)用力，從脊中線尾根部一直捏至大椎穴處共7遍，接著用四指齊捏背部中線兩側(cè)皮膚，從尾根部至大椎穴捏三提一，重點(diǎn)在肺俞、脾俞共3遍，力量以大鼠不尖叫且較平靜為度。操作中涉及的穴位按《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]比照人體穴位選取。捏脊法干預(yù)從實(shí)驗(yàn)的第10天始，持續(xù)到哮喘造模OVA激發(fā)前的第58天，其中OVA致敏前為每周一三五日各操作1次，OVA致敏期間的2周為每日操作1次。

1.5 大鼠體質(zhì)量變化趨勢及一般狀態(tài)觀察

脾虛造模過程中，觀察大鼠體質(zhì)量變化、食量、飲水量和肛溫的變化及活動(dòng)情況等，哮喘造模時(shí)觀察大鼠呼吸頻率、腹肌運(yùn)動(dòng)情況等。

1.6 大鼠肺組織病理學(xué)觀察

除正常對(duì)照組在生理鹽水末次激發(fā)后18 h隨機(jī)選取6只取材，其余每組在OVA末次激發(fā)后按隨機(jī)數(shù)字表法分為18 h和42 h組，每個(gè)時(shí)間段6只，25%烏拉坦5 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，迅速開胸、結(jié)扎并取出右肺上葉，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片、HE染色，光鏡下觀察。

1.7 ELISA檢測大鼠肺泡灌洗液中LXA4、PGE2、CysLTs水平

25%烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠，開胸結(jié)扎右肺葉后，將灌胃針連接于注射器，將2.5 mL生理鹽水緩慢注入氣管和左側(cè)肺中，立即緩慢抽回，再將所得液體緩緩注回肺內(nèi)，如此反復(fù)3次，最后1次邊回抽邊將注射器緩緩拔出，將灌洗液盛入塑料離心管，此為第1次灌洗，然后重復(fù)3次上述操作，并將離心管置于冰盒中。然后以4 ℃、2000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行ELISA檢測，檢測嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明進(jìn)行，測定吸光度值并換算成濃度水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

圖2 各組大鼠體質(zhì)量增長趨勢比較

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量增長趨勢比較

圖2顯示，從實(shí)驗(yàn)整個(gè)過程的體質(zhì)量變化趨勢來看，脾虛哮喘組和捏脊脾虛哮喘組體質(zhì)量增長速度顯著緩于正常對(duì)照組(P<0.01)，捏脊脾虛哮喘組體質(zhì)量增長速度顯著優(yōu)于脾虛哮喘組(P<0.05)。在哮喘造模結(jié)束時(shí)(第9周)，哮喘組體質(zhì)量較正常對(duì)照組有顯著下降(P<0.01)，捏脊脾虛哮喘組體質(zhì)量顯著高于脾虛哮喘組(P<0.05)。

2.2 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化

圖3顯示，正常對(duì)照組可見支氣管管壁和伴行動(dòng)脈周圍有稍許炎性細(xì)胞浸潤，支氣管管腔光滑，無炎性分泌物。哮喘組(18 h后)氣道壁變粗，氣道平滑肌增厚，支氣管管壁和伴行動(dòng)脈周圍有較多的炎性細(xì)胞浸潤，杯狀細(xì)胞增生，氣道腔內(nèi)可見炎性分泌物；哮喘組(42 h后)相對(duì)于哮喘組(18 h后)氣道管壁和動(dòng)脈周圍炎性細(xì)胞浸潤有所減輕，炎性分泌物有所減少。脾虛哮喘組(18 h后)炎性細(xì)胞浸潤比哮喘組(18 h后)更顯著，支氣管管壁顯著增厚，炎性分泌物增多；脾虛哮喘組(42 h后)與脾虛哮喘組(18 h后)比較，炎性程度變化不明顯。捏脊脾虛哮喘組(18 h后)的炎性病理變化程度比脾虛哮喘組減輕，與哮喘組相似；捏脊脾虛哮喘組(42 h后)的氣道管壁厚度及其動(dòng)脈周圍炎性細(xì)胞浸潤的程度比捏脊脾虛哮喘組(18 h后)有所減輕。

圖3 肺組織HE染色比較(哮喘造模后18和42 h) (×200)

2.3 各組大鼠BALF中PGE2、CysLTs和LXA4水平的變化

表1顯示，與正常對(duì)照組比較，在哮喘造模結(jié)束后18 h和42 h，哮喘組、脾虛哮喘組和捏脊脾虛哮喘組的PGE2水平均明顯上升(P<0.01)，且42 h水平均顯著高于18 h(P<0.01)。與哮喘組比較，在哮喘造模結(jié)束后18 h，脾虛哮喘組和捏脊脾虛哮喘組PGE2水平均顯著上升(P<0.01)；在42 h時(shí)，脾虛哮喘組水平仍顯著升高(P<0.01)，而捏脊脾虛哮喘組水平升高不顯著(P>0.05)，且顯著低于脾虛哮喘組(P<0.01)。與正常對(duì)照組比較，哮喘組、脾虛哮喘組和捏脊脾虛哮喘組的CysLTs水平均明顯上升(P<0.01)，且42 h水平顯著高于18 h時(shí)(P<0.01)；但脾虛哮喘組、捏脊脾虛哮喘組和哮喘組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組BALF中各脂質(zhì)介質(zhì)水平變化比較

注：與正常對(duì)照組比較：△△P<0.01；與哮喘組(18 h后)比較：▼▼P<0.01；與脾虛哮喘組(18 h后)比較：＊＊P<0.01；與哮喘組(42 h后)比較：☆☆P<0.01,☆P<0.05；與脾虛哮喘組(42 h后)比較：★★P<0.01,★P<0.05；與捏脊脾虛哮喘組(18 h后)比較：◇◇P<0.01

與正常對(duì)照組比較，在哮喘造模結(jié)束后，哮喘組、脾虛哮喘組和捏脊脾虛哮喘組的LXA4水平上升顯著(P<0.01)，且42 h時(shí)水平均顯著高于18 h時(shí)(P<0.01)，哮喘組LXA4/CysLTs比值雖有下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在哮喘造模結(jié)束后42 h時(shí)，脾虛哮喘組LXA4水平顯著低于哮喘組和捏脊脾虛哮喘組(P<0.05，P<0.01)，LXA4/CysLTs比值顯著低于哮喘組和捏脊脾虛哮喘組(P<0.01，P<0.05)，且顯著低于18 h；捏脊脾虛哮喘組LXA4水平高于哮喘組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

LXA4是SPMs中研究最多的一類，廣泛表達(dá)于上皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等，能限制或阻止中性粒細(xì)胞的浸潤，對(duì)抗調(diào)節(jié)PGE2和CysLTs，因此與哮喘密切相關(guān)，并能調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，有助于哮喘的炎癥消退[2]。研究顯示，哮喘患兒有系統(tǒng)性和氣管組織的LXA4水平明顯下降[8]，嚴(yán)重哮喘患者的外周血和BALF中LXA4水平下降，LXA4/CysLTs的比例明顯下降[9]。本研究結(jié)果顯示，哮喘大鼠肺部出現(xiàn)炎癥的同時(shí)，LXA4與CysLTs、PGE2水平均明顯升高，而LXA4/CysLTs的比值雖有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且隨著LXA4水平的升高，哮喘炎癥有緩解的趨勢。但脾虛使哮喘大鼠的CysLTs、PGE2水平更顯著升高，雖LXA4水平也在升高，但其升高幅度受影響，因此LXA4/CysLTs的比值顯著下降，哮喘的炎癥程度加重。與肺組織病理表現(xiàn)結(jié)合來看，本研究提示脾虛可能導(dǎo)致炎癥消退的延遲。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脾為生痰之源，肺為貯痰之器，脾失健運(yùn)、痰飲內(nèi)生、伏藏于肺成為哮喘的夙根。且小兒脾常虛，脾為肺之母，脾土不足也常累及肺，所以脾虛是兒童哮喘的重要病理特點(diǎn)之一[3]。近年研究顯示，脾虛動(dòng)物模型和患者多存在慢性炎癥[10]，結(jié)合此研究的結(jié)果提示脾虛可能影響炎癥的消退導(dǎo)致“伏痰”的產(chǎn)生，成為哮喘發(fā)生的重要病理機(jī)制。

捏脊法是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，運(yùn)用捏、提、捻、推手法刺激人體背部皮膚，從而防治疾病的一種外治方法。捏脊法主要循督脈和足太陽膀胱經(jīng)操作，有調(diào)陰陽、培元?dú)?、和臟腑的作用，尤善健脾[11]，故又被稱為“捏積法”。捏脊法由于易被兒童和家長所接受，也是中醫(yī)防治兒童哮喘的常用干預(yù)手段，有較好的臨床效果[4]。本研究結(jié)果顯示，捏脊法不但有助于改善脾虛體質(zhì)量增長緩慢的狀況，而且有助于明顯提升脾虛哮喘LXA4水平，降低CysLTs、PGE2水平，使LXA4/CysLTs的比值顯著上升，有助于緩解肺部炎癥。有研究表明，捏脊法可降低海馬中與炎癥相關(guān)的基因表達(dá)[12]。結(jié)合本研究結(jié)果提示，捏脊法可能通過提升LXA4水平促進(jìn)機(jī)體炎癥消退，這可能是捏脊法健脾祛伏痰防治兒童哮喘的重要機(jī)制之一。

4 結(jié)論

本研究表明，脾虛加重哮喘的肺部炎癥程度，并有減緩炎癥消退的趨勢。捏脊法有助于改善脾虛癥狀，減輕脾虛哮喘的肺部炎癥，并促進(jìn)炎癥的消退，這與其提升LXA4水平有一定的關(guān)系，可能是捏脊法防治兒童哮喘的重要機(jī)制之一。